2010-02-28 13:56:37 閱讀5 評(píng)論0 字號(hào)：大中小
《您會(huì)成為制作納豆的高手》與大家見(jiàn)面。 血栓疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病，包括心血栓、腦血栓、肺栓塞和末梢動(dòng)靜脈血栓等常見(jiàn)疾病。據(jù)估計(jì)，全世界有血栓性疾病患者約1500萬(wàn)人，其中每年死于心腦血栓疾病的就高達(dá)1200萬(wàn)人。在我國(guó)，血栓性疾病造成的損失也極為嚴(yán)重，尤其是隨著人們生活水平和生活方式改變導(dǎo)致膳食中高脂肪、高蛋白的過(guò)量攝取和老齡化社會(huì)的到來(lái)，血栓性疾病已超過(guò)癌癥和糖尿病成為第一健康殺手，每年約有100萬(wàn)人因此死亡。
目前臨床上治療血栓和栓塞主要是通過(guò)注射尿激酶（UK）、鏈激酶（SK）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、乙?；w溶酶原鏈激酶激活劑（APSAC）和單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（SCUPA）。些藥物均為纖溶酶原激活劑，通過(guò)激活纖溶酶原生成纖溶酶而降解纖維蛋白。在實(shí)際應(yīng)用中它們都具有一定的局限性，或是毒性比較強(qiáng)，易引起出血，不良反應(yīng)大；或是在體內(nèi)半衰期短,且不易被吸收,只能靜脈給藥,藥效難以發(fā)揮；或是來(lái)源緊缺,成本高,價(jià)格昂貴。
1987年，日本學(xué)者須見(jiàn)洋行等首次報(bào)道在納豆中存在一種具有強(qiáng)烈纖溶活性的酶—納豆激酶。20年來(lái),研究者們對(duì)納豆激酶的理化特性、作用機(jī)制及生產(chǎn)工藝等方面進(jìn)行了較為詳盡的研究。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),該酶不僅易于提取純化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，藥效時(shí)間長(zhǎng)，而且安全性好，無(wú)任何毒副作用。因此，有望成為一種新型溶栓藥物。
回復(fù)網(wǎng)友制作納豆的一些問(wèn)題
有不少網(wǎng)友在在制作納豆時(shí)關(guān)于無(wú)菌操作問(wèn)題,我告之一個(gè)小竅門:在煮沸水的水蒸氣上方就是無(wú)菌區(qū)域（用口徑大的水煲煮）,您可在上面操作,我曾搞過(guò)食用菌的繁殖及蘆薈組織培養(yǎng),肓種就是用這個(gè)土辦法的,百試百靈。
也有不少網(wǎng)友提到如何在寒冬制作納豆時(shí)的保溫保濕問(wèn)題,我也告之一個(gè)行之有效的土辦法:為了保證酸奶機(jī)內(nèi)溫度的恒定,保持酸奶機(jī)內(nèi)濕度的足夠,就得提高酸奶機(jī)外的溫度和濕度。有一個(gè)簡(jiǎn)易的做法,就是用兩個(gè)大小不同的紙皮箱,小的紙皮箱能放置酸奶機(jī)及加濕熱即可, 大小紙箱之間填充泡沫作保溫層,在小箱內(nèi)的上方掛兩只串聯(lián)的20或40瓦(瓦數(shù)要相同)的燈泡(一定要串聯(lián),才會(huì)產(chǎn)生紅外線而生熱量)供箱體產(chǎn)熱之用,我過(guò)去曾用此法繁殖家禽呢,很好用。干燥季節(jié)記得開(kāi)加濕機(jī)加濕。
有不少熱衷于制作納豆的網(wǎng)友,在實(shí)踐中都或多或少會(huì)有點(diǎn)新的想法:納豆菌種有點(diǎn)貴(50-100元/瓶，只能制作納豆三十次), 為了減少成本,有什么辦法在原有的菌種能多做些納豆嗎？如何提高納豆里納豆激酶的含量？有什么辦法改善納豆的口感？還可制作其他納豆產(chǎn)品嗎？還有……。
本文收集了不少有關(guān)制作納豆的資料,內(nèi)容豐富,值得一看.當(dāng)您利用了這些資料制作納豆時(shí),上面種種急待解決的難題便會(huì)迎刃而解了.您會(huì)感到如虎添翼,得心應(yīng)手.您將會(huì)成為制作納豆的高手。
如人們每天都能以納豆為食，長(zhǎng)壽將與您共存！
納豆菌的培育
提供一種簡(jiǎn)捷、有效的納豆菌培育繁殖方法。
上述目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
用水浸泡大豆，大豆膨脹到2倍左右時(shí)，蒸或煮熟，按與浸泡前大豆重量4000—10000：l的比例取納豆菌菌種放進(jìn)容器，加入菌種量1000-1500倍的60-100℃溫開(kāi)水或開(kāi)水稀釋菌種；將植入菌種的熟大豆進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37—40℃，發(fā)酵時(shí)間20—24小時(shí)，納豆菌便得到培育繁殖。
也可用納豆培育納豆菌：用水浸泡大豆，大豆膨脹到2倍左右時(shí)，蒸或煮熟，按與浸泡前大豆重量40：1的比例將納豆直接加入熟大豆中，拌勻均勻，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37-40℃，發(fā)酵時(shí)間20-24小時(shí)，納豆菌便得到培育繁殖。
以納豆菌為菌種、用熟大豆作培養(yǎng)基，通過(guò)接種、發(fā)酵達(dá)到培育繁殖納豆菌的目的。其特點(diǎn)是：材料易取、設(shè)備簡(jiǎn)單、方法有效。
具體實(shí)施方式
1、挑選大豆。去掉大豆中的雜質(zhì)以及蟲(chóng)蠹、發(fā)霉的豆粒。
2、清洗大豆。將大豆置于清洗容器中，加上足夠凈水清洗大豆，洗凈后撈出大豆倒入浸泡容器中。
3、浸泡大豆。在浸泡容器中加入2.5-3倍于大豆的凈水，蓋上容器，以防進(jìn)入異物。浸泡10—16小時(shí)，待大豆膨脹到2倍左右時(shí)，撈出大豆空掉水分。
4、蒸煮大豆。在使用壓力鍋的情況下，將浸泡好的大豆蒸50—70分鐘(視鍋內(nèi)壓力而定)。如不使用壓力鍋，蒸煮時(shí)間為l80-240分鐘。大豆熟透標(biāo)準(zhǔn)：用手指輕輕一捏就破即可。
5、器具消毒。將容器、勺子、筷子及橡膠手套用開(kāi)水沖煮、除去雜菌。
6、調(diào)配菌液。戴上滅過(guò)菌的橡膠手套，按與浸泡前大豆重量4000—10000：1的比例(大豆4000-10000份、納豆菌1份)取菌種放進(jìn)容器，加入納豆菌1000—1500倍量的60一100℃溫開(kāi)水或開(kāi)水，用勺子攪拌稀釋菌種。
如果沒(méi)有現(xiàn)成納豆菌，可用新鮮納豆替代。在使用新鮮納豆的情況下，不必用水稀釋。將熟透大豆控掉水分、倒進(jìn)消過(guò)毒的容器中。容器中熟大豆的厚度以2～3厘米為益。按40：l的比例(40份熟大豆、1份新鮮納豆)將納豆直接攙入熟大豆中，用消過(guò)毒的筷子輕輕將菌種、熟大豆攪拌均勻。
7、恒溫發(fā)酵。將植入菌種的熟大豆放進(jìn)發(fā)酵箱、發(fā)酵罐或發(fā)酵室(窖)。溫度以控制在37-40℃為宜，發(fā)酵時(shí)間可掌握在20-24小時(shí)。也可將植入菌種的熟大豆放在30-37℃的環(huán)境中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間24-48小時(shí)。
通過(guò)上述工序，納豆菌便得到了培育繁殖。
根據(jù)需要，可以把發(fā)酵好的大豆分別進(jìn)行如下處理：
(1)用3-5倍的涼開(kāi)水把發(fā)酵好的大豆稀釋成納豆液、濾去其中大豆，將納豆菌液裝進(jìn)無(wú)菌容器冷凍保存。
(2)利用離心方式或板框過(guò)濾、噴霧干燥方式將稀釋的納豆液提純成納 豆菌. (3)將納豆液置于一3℃一0℃的恒溫環(huán)境中，3日之后，納豆液中的納豆菌變成胞子，再在常溫中利用離心方式或板框過(guò)濾、噴霧干燥方式提純。
納豆的制作
提供一種工藝簡(jiǎn)單、操作方便的納豆食品的制作方法。
大豆食品的制作方法，包括下述步驟：
①將大豆清洗后，將其破碎成粒度為3-6mm的顆粒；
②將上述大豆顆粒用3倍量的水進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為8～36小時(shí)；
③將浸泡好的大豆放進(jìn)鍋內(nèi)蒸1.5~2.5小時(shí)，或用普通高壓鍋煮10-20分鐘；
④將蒸煮熟的大豆裝入無(wú)菌罐內(nèi)，同時(shí)噴灑發(fā)酵劑5～10ml／kg，所述發(fā)酵劑為含有0.05～0.15％的鹽、0.15～0.3％發(fā)酵大豆和2-3％的無(wú)菌水；
⑤將上述接種后的大豆均勻平鋪于無(wú)菌容器中，厚度為2～3cm，再噴灑發(fā)酵劑7-15ml／kg，然后密閉；
⑥將上述密閉容器置于37-42度條件下培養(yǎng)20～24小時(shí)，發(fā)酵完成得到納豆。
所述納豆在O℃冷藏保存或進(jìn)行分裝冷藏保藏。所述制作過(guò)程空氣的相對(duì)濕度為25～55％。
實(shí)施例1：
將大豆l000g進(jìn)行徹底清洗，將洗凈的大豆破碎，破碎成粒度為3～6mm的顆粒(一般一粒大豆被破為6瓣左右)，然后用3000g的水進(jìn)行浸泡，夏季浸泡時(shí)間為8～12小時(shí)，以使大豆吸水重量增加2~2.5倍為最好：將浸泡好的大豆放進(jìn)鍋內(nèi)蒸2.0小時(shí)：將蒸煮熟的大豆裝入無(wú)菌罐內(nèi)，同時(shí)噴灑發(fā)酵劑，發(fā)酵劑為含有15mg的鹽、20mg糖、發(fā)酵大豆300mg的無(wú)菌水；將上述接種后的大豆均勻平鋪于無(wú)菌容器中，厚度為2～3cm，再次噴灑發(fā)酵劑，然后密閉；將上述密閉容器置于37～42度條件下培養(yǎng)20～24小時(shí)，發(fā)酵完成得到納豆。
納豆在O℃冷藏保存或進(jìn)行分裝冷藏保藏。
生產(chǎn)過(guò)程中接觸原料的所有器具均要進(jìn)行滅菌、消毒，以避免雜菌的混入，并且生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)境相對(duì)濕度一般控制在25-55％。
實(shí)施例2：
將大豆5000g進(jìn)行徹底清洗，將洗凈的大豆破碎，破碎成粒度為3-6mm的顆粒(一般一粒大豆被破為6瓣左右)，然后用l5000g的水進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間為20-24小時(shí)，以使大豆吸水重量增加2～2.5倍為最好；將浸泡好的大豆放進(jìn)普通高壓鍋，在充分放氣后煮l5～20分鐘；將蒸煮熟的大豆裝入無(wú)菌罐內(nèi)，同時(shí)噴灑發(fā)酵劑，發(fā)酵劑為含有50mg的鹽、lOOmg糖、l000mg發(fā)酵大豆的無(wú)菌水；將上述接種后的大豆均勻平鋪于無(wú)菌容器中，厚度為2～3cm，再次噴灑發(fā)酵劑，然后密閉；將上述密閉容器置于37~42℃條件下培養(yǎng)20-24小時(shí)，發(fā)酵完成得到納豆。
生產(chǎn)過(guò)程中接觸原料的所有器具均要進(jìn)行滅菌、消毒，以避免雜菌的混入，并且生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)境相對(duì)濕度一般控制在25～55％。
實(shí)施例3：
將大豆l0000g進(jìn)行徹底清洗，將洗凈的大豆破碎，破碎成粒度為3～6mm的顆粒(一般一粒大豆被破為6瓣左右)，然后用30000g的水進(jìn)行浸泡，夏季浸泡時(shí)間為8～12小時(shí)，以使大豆吸水重量增加2～2.5倍為最好；將浸泡好的大豆放進(jìn)鍋內(nèi)蒸2.5小時(shí)；將蒸煮熟的大豆裝入無(wú)菌罐內(nèi)，同時(shí)噴灑發(fā)酵劑，發(fā)酵劑為含有200mg的鹽、250mg的糖、2500mg的發(fā)酵大豆的無(wú)菌水；將上述接種后的大豆均勻平鋪于無(wú)菌容器中，厚度為2—3cm，再次噴灑發(fā)酵劑，然后密閉；將上述密閉容器置于37-42℃條件下培養(yǎng)20-24小時(shí)，發(fā)酵完成得到納豆。
實(shí)施例4： 將大豆l0000g進(jìn)行徹底清洗，將洗凈的大豆破碎，破碎成粒度為3—6mm的顆粒(一般一粒大豆被破為6瓣左右)，然后用30000g的水進(jìn)行浸泡，夏季浸泡時(shí)間為8～12小時(shí)，以使大豆吸水重量增加2~2.5倍為最好；將浸泡好的大豆放進(jìn)鍋內(nèi)蒸2.5小時(shí)；將蒸煮熟的大豆裝入無(wú)菌罐內(nèi)，同時(shí)噴灑發(fā)酵劑，發(fā)酵劑為含有200mg的鹽、250mg的糖、2500mg的發(fā)酵大豆的無(wú)菌水；將上述接種后的大豆均勻平鋪于無(wú)菌容器中，厚度為2～3cm，再次噴灑發(fā)酵劑，然后密閉；將上述密閉容器置于30℃自然環(huán)境中培養(yǎng)3～5天，發(fā)酵完成得到納豆。
納豆激酶制備
目前，采用固體或液體發(fā)酵培養(yǎng)微生物，使其產(chǎn)生納豆激酶，然后再?gòu)陌l(fā)酵產(chǎn)物中以常規(guī)提取純化的方法制備納豆激酶。各種制備方法的差異主要集中在使用的納豆原材料方面，現(xiàn)分別介紹如下
實(shí)例 238 豆豉纖溶酶制備
納豆激酶分布于發(fā)酵液中，過(guò)濾除去菌體，以硫酸鐵鹽析獲得粗品酶，再以離子交換樹(shù)脂、分子篩進(jìn)行純化，最后進(jìn)行真空干燥，獲得純化納豆激酶。
( l ）工藝流程
( 2 ）主要步驟
① 種子培養(yǎng)基
稱取2. 0 份麥芽糖、2.0 份果糖、1.5 份大豆胨、0.2 份酵母浸膏、0.1 份KH2PO4 、0. 3 份K2HPO4 、0.05 份MgSO4? 5H2O 、0.02 份CaC12 ? 2H2O ，然后用去離子水補(bǔ)充至100份。配制成pH 值為7.0的種子培養(yǎng)基
將制備好的種子培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，滅菌溫度為121 ℃ ，時(shí)間為20- 30min 。滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至30 ℃ 時(shí)，在無(wú)菌條件下接種培養(yǎng)基體積2 ％的菌抱子懸液，混合均勻后置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，在振幅為25mm 、轉(zhuǎn)速為27Or / min 、30 ℃ 振蕩培養(yǎng)18h ，獲得一級(jí)種子。
② 發(fā)酵培養(yǎng)基
稱取2.0份麥芽糖、2.0 份果糖、30.0 份大豆?jié){、0.2 份酵母浸膏、0.1份KH2PO4、0 .3 份K2HPO4、0.05 份MgS04.5H2O 、0.02 份CaCI2? 2H2 O ，用去離子水補(bǔ)充至100份，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基，其pH 值為7.0
③ 發(fā)酵
在容積為8L 的LF2G5A 型自控發(fā)酵罐中加入5L 發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行自動(dòng)定溫滅菌。滅均溫度及時(shí)間同種子培養(yǎng)基高壓滅菌。然后在無(wú)菌條件下順序?qū)⒎N子培養(yǎng)液和經(jīng)高壓滅菌的甘油聚醚消泡劑加入，種子培養(yǎng)液用量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2 % ，消泡劑用量則為0.1 % （體積分?jǐn)?shù)）?？刂瓢l(fā)酵溫度為（30 士0.2 ）℃ ，pH 值為7.0 ，攪拌轉(zhuǎn)速為8O0r / m 動(dòng)，通入無(wú)油三級(jí)過(guò)濾空氣，通氣量為1 倍發(fā)酵液體積／min ，發(fā)酵時(shí)間為76h 。
④ 除雜蛋白
發(fā)酵完成后放罐，將發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，離心機(jī)速度為5000r / min ，時(shí)間為20min 。收集上層清液，置于鹽析罐中，控制上清液溫度低于10 ℃ ，在攪拌下加入硫酸鐵，直至飽和度達(dá)到25 ％時(shí)停止攪拌，靜置直至雜蛋白沉淀析出。5000r / min 離心20min ，除去雜蛋白沉淀。
⑤ 鹽析、超濾
收集離心上層清液，再次控制其溫度低于10 ℃ ，在攪拌下加入硫酸按，直至飽和度達(dá)到60％時(shí)停止攪拌，然后在同溫度下靜置過(guò)夜。次日虹吸棄上清液，下層濁液進(jìn)行離心分離，離心機(jī)速度為5000r / min ，離心時(shí)間20min 。收集沉淀，用少量去離子水溶解后進(jìn)行超濾除鹽，獲得豆豉纖溶酶粗品。測(cè)定其酶活力，備用。
⑥ 純化
根據(jù)Sephadex G2100 的容量及豆豉纖溶酶粗品的酶活力計(jì)算出所需樹(shù)脂量，稱取定量樹(shù)脂，用去離子水進(jìn)行溶脹處理。將溶脹2 天的Sephadex G2100 裝入色譜柱，用0.lmol / L 磷酸緩沖液（PBS）-0.2mol /L NaCI( pH7.4）緩沖液進(jìn)行平衡。然后，將粗酶液小心加入柱中，以相同緩沖液進(jìn)行脫洗，用分部收集器收集有纖溶活性的組分，即為精制豆豉纖溶酶。
此外，還可以用CM -SepharoseFF 離子交換色譜、Superdex75 凝膠色譜等進(jìn)行精制。用SePhacryls2200 柱色譜純化豆豉纖溶酶的主要步驟為：將Sephacryls2200 樹(shù)脂裝柱，用0 . lmol / L PBS、0.5mol/ LNaCI 緩沖液（pH 值7 . 4 ）進(jìn)行平衡，然后上樣，并以相同緩沖液洗脫。分部收集呈單一對(duì)稱峰的活性組分，用蒸餾水透析過(guò)夜及冷凍干燥，獲得白色粉末豆豉纖溶酶。
( 3 ）主要指標(biāo)經(jīng)Sephadex G2100 色譜純化的豆豉纖溶酶：純化28 倍，收得率為51 % ；經(jīng)Sephacryls2200 色譜純化的豆豉纖溶酶：純化44 倍，收得率為68 ％。獲得的豆豉纖溶酶平均分子量為31000 , PI 為8.6 士0.2 ，豆豉纖溶酶在40 ℃ 以下穩(wěn)定性良好，50 ℃ 放置lh 則嚴(yán)重失活，60 ℃ 活性全部喪失。該酶在pH 值為7 - 11 穩(wěn)定，而在pH 值低于5 時(shí)很快失活。
生產(chǎn)納豆激酶
一種利用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)產(chǎn)生上述納豆激酶的方法，其特征是：
利用大豆蛋白胨等氮源、多糖類物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為36.5—37.5℃，發(fā)酵周期l6-50小時(shí)，pH 6.5-7.5。經(jīng)過(guò)離心、超濾后，將上清液中加入冷乙醇使其含量達(dá)70-80％，或者加固體硫酸銨使飽和度達(dá)60-70％，低溫沉淀后離心，干燥粉碎，得到納豆激酶的粗干粉，經(jīng)凝膠層析后得到純化產(chǎn)品。
上述的利用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)產(chǎn)生上述納豆激酶的方法，所述的氮源、多糖類物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽可以選擇：
a．固體發(fā)酵：采用大豆作為發(fā)酵基質(zhì)。
b．液體發(fā)酵：多糖類物質(zhì)采用麥芽糖、木糖、蔗糖，使用量為：l-8％(重 量比)，或者利用麥芽汁作為碳源，C增加0.1-2％(重量比)酵母膏，氮源采用大豆蛋白胨、豆餅粉，使用量1-10％(重量比)，或者利用豆 漿作為發(fā)酵物質(zhì)。
c所述的無(wú)機(jī)鹽：KH2P04 0.1％，K2HP04 0.3％，MgS04.5H20 0.05％，CaCi2.H20 0.02％。
上述的利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶的用途，將利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶按照常用的酶單位加入到淀粉或者糊精中，其加入量為每200毫克裝量中含5000-10000U納豆激酶，制成腸溶膠囊，用于治療心腦血管疾病藥品.
一種上述的利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶的用途，將利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶按照常用的酶單位加入到丹參粉、地龍粉中，其重量配比為：納豆激酶l00-150萬(wàn)酶單位，丹參粉50克，地龍粉30克，制成腸溶膠囊或者口服液，用于治療心腦血管疾病藥品。
一種上述的利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶的用途，將納豆激酶的純化產(chǎn)品經(jīng)冷凍干燥制成醫(yī)用注射針劑。
這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果：
1．納豆激酶是使用枯草芽孢桿菌高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的高活性的納豆激酶，是一種具有較高溶纖性能的蛋白激酶，針對(duì)纖維蛋白的降解有特異性的顯著效果，經(jīng)臨床檢驗(yàn)，該產(chǎn)品具有明顯溶解人體血管內(nèi)血栓的的活性，
可以用于多種心腦血管疾病的治療。
2．產(chǎn)品克服了該類產(chǎn)品只能靜脈給藥的方式，可以制成口服產(chǎn)品，可以通過(guò)腸道吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，用于血栓治療，其釋放時(shí)間長(zhǎng)，并可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活因子，激活生物體自身的纖溶酶系統(tǒng)，提高血液的纖溶性能。
3．納豆激酶是使用枯草芽孢桿菌高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的高活性的
納豆激酶，液體發(fā)酵的最高酶活性達(dá)每毫克200尿激酶單位，固體發(fā)酵達(dá)每毫克20尿激酶單位，比野生的菌株高十多倍，并且生產(chǎn)原料易得，成本低，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，所生產(chǎn)的納豆激酶的活性高。
4．產(chǎn)品的穩(wěn)定性明顯好于已有的其他原料制成的的產(chǎn)品，在室溫下，本產(chǎn)品每月取樣一次，檢驗(yàn)酶的活性，經(jīng)過(guò)一年酶活性不變。在PH5—10的范圍內(nèi)，其性能十分穩(wěn)定，并且本產(chǎn)品在50℃以內(nèi)活性均不下降。
5．通過(guò)動(dòng)靜脈旁路血栓法檢測(cè)的結(jié)果表明，加入納豆激酶的小中大劑量組均與生理鹽水對(duì)照組產(chǎn)生顯著的差異，說(shuō)明其對(duì)于抑制血栓形成有作用，其中特別是中大劑量組，與使用常規(guī)產(chǎn)品的對(duì)照組相比，有更明顯的差異。這說(shuō)明納豆激酶除抑制血栓形成外，還具有溶栓效果。同時(shí)各劑量組之間具有依賴關(guān)系。根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)者血液中FIB(纖維蛋白原)、FDP(纖維蛋白降解產(chǎn)物)和D．diver的含量測(cè)定，納豆激酶可以明顯降低FIB的含量，使FDP顯著增高，由此證實(shí)納豆激酶具有激活纖溶酶的作用。報(bào)告附后。
6．經(jīng)過(guò)國(guó)家認(rèn)可的指定單位進(jìn)行急性毒性檢驗(yàn)，該產(chǎn)品符合人用藥品的要
求。報(bào)告附后。
實(shí)施例1：
一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶，所述的菌種是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtitis)Hw4—1CGMCC．N00718，該菌種于2000年10月30日鑒定，并于2002年的2月27日送CGMCC保藏，其存活證明已經(jīng)提交國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局。該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類，由275個(gè)氨基酸組成，分子量27730道爾頓，’等電點(diǎn)pl值為8．6。
其枯草芽孢桿菌的菌種特性為：
1．形態(tài)特征：于37℃培養(yǎng)l-2天后，菌體為短桿狀，有時(shí)成鏈，直形， (0.5-0.7)×(1.5-1.8)微米，有芽孢，芽孢亞端生，不膨大，橢圓形，芽孢不多于l個(gè)，革蘭氏染色為陽(yáng)性。
2．培養(yǎng)特征：在LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)l-2天后，菌落呈乳脂色，邊緣不光滑，表面粗糙，呈皺褶狀，菌落不粘，易挑起。
3．生理生化特性：
接觸酶十，氧化酶一，VP試驗(yàn)+，VP<pH6+，VP>Ph7一，明膠液化+，分解酪素+，淀粉水解一，硝酸鹽還原+。利用碳水化合物產(chǎn)酸：葡萄糖+，木糖+，L一阿拉伯糖一，甘露醇+ 利用葡萄糖產(chǎn)氣一，利用檸檬酸鹽一，甲基紅試驗(yàn)+。
實(shí)施例2：．
上述納豆激酶的生產(chǎn)方法：
利用大豆蛋白胨等氮源、多糖類物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為36.5-37.5℃，發(fā)酵周期16-50小時(shí)，pH 6.5—7.5。經(jīng)過(guò)離心、超濾后，將上清液中加入冷乙醇使其含量達(dá)70-80％，或者加固體硫酸銨使飽和度達(dá)60—70％，低溫沉淀后離心，干燥粉碎，得到納豆激酶的粗干粉，經(jīng)凝膠層析后得到純化產(chǎn)品。
上述的利用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)產(chǎn)生上述納豆激酶的方法，所述的氮源、多糖類物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽可以選擇：
a．固體發(fā)酵：采用大豆作為發(fā)酵基質(zhì)。
b．液體發(fā)酵：多糖類物質(zhì)采用麥芽糖、木糖、蔗糖，使用量為：l-8％(重
量比)，最佳量為1.5-4％，或者利用麥芽汁作為碳源，增加0.1-2％(重量比)酵母膏，以提高納豆激酶的產(chǎn)量。氮源采用大豆蛋白胨、豆餅粉，使用量l-10％(重量比)，其最佳量為2-5％，或者利用豆?jié){作為發(fā)酵物質(zhì)。
c．所述的無(wú)機(jī)鹽：KH2P04 0.1％，K2HP04 0.3％，MgS04·5H20 0.05％，CaCl2·H20 0.02％。
發(fā)酵罐培養(yǎng)的條件：
通氣量控制為：(1：0.5)一(1：1)V／V／min，攪拌200-400rpm，罐溫為36.5-37.5℃之間，罐壓為0.03-0.05Mpa．
發(fā)酵：
采用固體發(fā)酵時(shí)，應(yīng)當(dāng)精選大豆，泡24小時(shí)，121℃滅菌一小時(shí)，冷卻后進(jìn)行接種發(fā)酵。發(fā)酵的相對(duì)濕度為80-95％，溫度為36-38℃，周期為20小時(shí)以上，一般不必超過(guò)50小時(shí)。
發(fā)酵后可以進(jìn)行提取，用1-2倍量的含2mM CaCL2的生理鹽水在低溫下攪拌抽提1-2小時(shí)后，進(jìn)行過(guò)濾，離心30-40分鐘，棄沉淀，收集上清液，加入低溫乙醇至乙醇含量達(dá)到70-80％，或加入固體硫酸銨至飽和度達(dá)到60—70％，低溫過(guò)夜沉淀，離心后真空抽干，將沉淀粉碎，即得納豆激酶的粗干粉。
如果采用的是液體發(fā)酵，則直接進(jìn)行低溫離心，除去菌體，并超濾濃縮1—10倍，加入低溫乙醇至乙醇含量達(dá)到70—80％，或加入固體硫酸銨至飽和度達(dá)到60-70％，低溫過(guò)夜沉淀，離心后真空抽干：將沉淀粉碎，即得納豆激酶的粗干粉。
純化：
將納豆激酶粗干粉用Tris·HCL緩沖液溶解后，使用Butyl Sepharose4FF
疏水層析柱進(jìn)行組分分離，收集高活性組分。透析濃縮后，用CM離子交換柱
分離，收集活性組分。反滲濃縮后，進(jìn)行SephadexG．100分子篩凝膠柱層析，
收集活性組分。經(jīng)透析濃縮后，得到納豆激酶的純化產(chǎn)品。
實(shí)施例3：
上述的利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶的用途，將利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶按照常用的酶單位5000U-10000U加入到淀粉或者糊精中，制成腸溶膠囊，用于治療血栓類的心腦血管疾病的藥品。
每日3次，每次2粒。
實(shí)施例4：
一種上述的利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的納豆激酶的用途，將利用枯草芽孢桿
菌生產(chǎn)的納豆激酶按照常用的酶單位加入到丹參粉、地龍粉中，其重量配比為：納豆激酶l00-150萬(wàn)酶單位，丹參粉50克，地龍粉30克，共同制成納米級(jí)微粒后，制成腸溶膠囊或者口服液，作為心血管疾病易發(fā)人群的保健品，用于預(yù)防血栓類的心腦血管疾病的藥品。
納豆激酶的生產(chǎn)
提供一種得率高，酶活高，成本低，可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的納豆激酶的生產(chǎn)方法。
依次包括下述兩個(gè)步驟：
一、發(fā)酵；
所述第的發(fā)酵是固體發(fā)酵，該發(fā)酵過(guò)程依次有如下工序，
①用特制浸泡液浸泡優(yōu)質(zhì)黃豆，所述的特制浸泡液的配方為：牛肉浸膏5～l0g，蛋白胨4～12g，酵母浸出汁3—8g，NaCl 5～l0g，葡萄糖l5～20g，自來(lái)水l000ml，PH值為6.8～7，浸泡到黃豆吸足水份，豆無(wú)硬心，表面無(wú)皺紋為止；
②裝瓶滅菌接種：采用常規(guī)滅菌方法，等瓶溫自然冷卻至40℃以下，在無(wú)菌條件下接種，接種所用的菌種是枯草芽孢桿菌；
③培育：采用常規(guī)培養(yǎng)條件；
采用高低溫培養(yǎng)方法，先在37℃下培養(yǎng)22—32小時(shí)后馬上轉(zhuǎn)入3～10℃條件下保溫，l2～24小時(shí)獲得發(fā)酵物。
二、將經(jīng)發(fā)酵步驟后得到的干燥物粉碎；
①干燥：采用常規(guī)方法。
干燥工序中采用的是將發(fā)酵物進(jìn)行低溫真空冷凍干燥，發(fā)酵物水分小于l5％時(shí)干燥結(jié)束。
②粉碎是采用細(xì)胞破壁技術(shù)。
上述生產(chǎn)方法培養(yǎng)的納豆激酶制備的納豆激酶溶栓藥物，其特殊之處在于：制備片劑、沖劑、硬膠囊、軟膠囊或口服液時(shí)，在所得產(chǎn)物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糊精(等)配料調(diào)整至每克內(nèi)有200～680的酶活單位。
上述生產(chǎn)方法培養(yǎng)的納豆激酶制備的納豆激酶溶栓藥物每克內(nèi)有200～380的酶活單位，具有預(yù)防心血管疾病的作用。
上述生產(chǎn)方法培養(yǎng)的納豆激酶制備的納豆激酶溶栓藥物每克內(nèi)有300～680的酶活單位，具有治療心血管疾病的作用。
上述生產(chǎn)方法培養(yǎng)的納豆激酶制備的凍干粉每克內(nèi)含大于800的酶活單位，制備的針劑純度達(dá)95％以上。
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)方案作詳細(xì)敘述：
第一部分：納豆激酶的生產(chǎn)方法
1、使用特制浸泡液的實(shí)施例及其與使用常規(guī)浸泡液的產(chǎn)物酶活比較實(shí)驗(yàn)條件：300ml三角瓶加入特制浸泡液浸泡過(guò)的大豆l0g，調(diào)PH7，121℃滅菌15min，接入枯草芽孢桿菌斜面菌種，在37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，常規(guī)干燥、常規(guī)粉碎后測(cè)定酶活。
浸泡液
例
牛肉浸膏
蛋白胨
酵母浸出液
NaCl
葡萄糖
測(cè)定酶活
特
1
5
4
3
5
15
制
2
6
5
4
6
17
平
浸
3
7
8
5
7
19
均
泡
4
8
lO
6
8
16
490 U／g
液
5
9
12
8
9
20
常規(guī)浸
泡液
自來(lái)水
230 u／g
2、高低溫培養(yǎng)條件實(shí)施例及其與常規(guī)培養(yǎng)條件下的產(chǎn)物酶活比較：
實(shí)驗(yàn)條件：500ml三角瓶?jī)?nèi)加入經(jīng)特制浸泡液浸泡過(guò)的大豆30g，調(diào)PH7，在121℃條件下滅菌30min接入枯草芽孢桿菌種子菌種培養(yǎng)，再經(jīng)常規(guī)干燥、常規(guī)粉碎后測(cè)定酶活。
培養(yǎng)
培養(yǎng)條件
測(cè)定酶活u／g
常規(guī)培
養(yǎng)條件
37℃條件下培養(yǎng)24-28小時(shí)
510
1
37℃條件下培養(yǎng)24h，放入3℃條件下再培養(yǎng)24 h
高低溫
2
37℃條件下培養(yǎng)24h，放入5℃條件下再培養(yǎng)18 h
平
培養(yǎng)條
3
37℃條件下培養(yǎng)24h，放入8℃條件下再培養(yǎng)15 h
均
件
4
37℃條件下培養(yǎng)24h，放入l0℃條件下再培養(yǎng)12h
690
3、干燥與粉碎工序?qū)嵤├?，使用原料為?jīng)特制浸泡液浸泡，經(jīng)高低溫培養(yǎng)制得的發(fā)酵豆。
例
干燥
破碎
酶活
l
常溫常壓下干燥
常規(guī)方法粉碎
690u／g
2
低溫真空冷凍干燥
常規(guī)方法粉碎
810 u／g
3
常規(guī)干燥
細(xì)胞破壁
780 u／g
4
低溫真空冷凍干燥
細(xì)胞破壁
880 u／g
由上述實(shí)施例可以看出，使用特制浸泡液、采用高低溫培養(yǎng)條件、采用低溫真空冷凍干燥及細(xì)胞破壁技術(shù)均對(duì)提高產(chǎn)物酶活有重要作用。
第二部分：用于治療心血管疾病的納豆激酶溶栓藥物
1、制備片劑、沖劑、硬膠囊、軟膠囊時(shí)，在固體發(fā)酵所得產(chǎn)物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糊精等配料調(diào)整至每克內(nèi)有200～680的酶活單位。
例
第一部分最終產(chǎn)物
添加配料
調(diào)整酶活單位
作用
用量
顯效率
1
690u／g
可溶性淀粉
200u／g
預(yù)防
3g
明顯
2
780u／g
麥芽糊精
250 u／g
預(yù)防
3g
明顯
3
810 u／g
葡萄糖
300 u／g
預(yù)防
3g
明顯
4
880u／g
葡萄糖
350U/g
預(yù)防
3g
明顯
5
780 u／g
可溶性淀粉
500u／g
治療
3g
明顯
6
690u／g
葡萄糖
560u／g
治療
3g
明顯
7
810u／g
麥芽糊精
380 u／g
治療
3g
明顯
8
880 u／g
葡萄糖
680 u／g
治療
3g
明顯
用量到18克即有明顯效果：預(yù)防時(shí)，l日1次，每次3克；治療時(shí)，l日
2次，每次3克。
2、用常規(guī)方法制備的凍干粉。
例
第一部分最終產(chǎn)物
調(diào)整酶活單位
作用
用量
顯效率
1
690u／g
200u／g
治療
3g
明顯
2
780u／g
250u／g
治療
3g
明顯
3
810 u／g
300 u／g
治療
3g
明顯
4
880u／g
350u／g
治療
3g
明顯
用量到l8克即有明顯治療效果，按病情由輕至重依次按實(shí)施例1-4確定
具體的用量數(shù)，1日2次，每次3克，共6次，
3、用常規(guī)方法制備的針劑。
例
第一部分最終產(chǎn)物
調(diào)整酶活單位
作用
用量
顯效率
1
690u／g
800u／g
治療
lg
明顯
2
780u／g
850 u／g
治療
lg
明顯
3
810 u／g
900 u／g
治療
lg
明顯
4
880u／g
950u／g
治療
lg
明顯
用量到18克即有明顯治療效果，按病情由輕至重依次按實(shí)施例1~4確定具體的用法。
納豆激酶的制造
提供了一種回收率較高的納豆激酶的制造方法。
提供一種納豆激酶的制造方法，其包括如下步驟：發(fā)酵，將納豆激酶從納豆菌釋放出來(lái)，發(fā)酵液中含有納豆激酶及菌體;將發(fā)酵液中納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，釋放出發(fā)酵過(guò)程中，卡在細(xì)胞壁的納豆激酶；將細(xì)胞壁破碎后的發(fā)酵液離心并收集上清液；純化所述上清液，獲得純化后的納豆激酶溶液。
提供的納豆激酶的制造方法中，包括了細(xì)胞破碎的步驟，即將納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，將細(xì)胞壁破碎后，可以將在發(fā)酵過(guò)程中被卡在納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶均釋放出來(lái)。因此，相較于先前技術(shù)的納豆激酶的制造方法，提供的納豆激酶的制造方法可較大程度上提升納豆激酶的回收率。而且，針對(duì)同一發(fā)酵方法，提供的納豆激酶的制造方法可將納豆激酶的回收率提升40～50％。
具體實(shí)施方式一：
1)發(fā)酵
從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入l0毫升的種子培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)／分鐘(rpm)下?lián)u床培養(yǎng)8小時(shí)，按l％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，再于28℃、150轉(zhuǎn)／分鐘下發(fā)酵罐培養(yǎng)l00小時(shí)。發(fā)酵過(guò)程中，納豆激酶會(huì)從納豆菌中釋放出來(lái)，液體中含有納豆激酶及菌體。
2)細(xì)胞破碎
如上所述，在發(fā)酵過(guò)程中，納豆激酶會(huì)從納豆菌中釋放出來(lái)。經(jīng)研究表明，發(fā)酵只能釋放出納豆菌中所含有的部分納豆激酶，約有50％左右的納豆激酶受到納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁的阻礙，會(huì)卡在納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁而未能從納豆菌細(xì)胞中釋放出來(lái)，因此現(xiàn)有技術(shù)納豆激酶的制造方法無(wú)法利用卡在納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶，因此，總是無(wú)法達(dá)到理想的回收率。
為解決此問(wèn)題，提供了細(xì)胞破碎的步驟，即將納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎。將細(xì)胞壁破碎后，可以將先前技術(shù)中被卡在納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶均釋放出來(lái)，因此，可較大程度上提升納豆激酶的回收率。
提供的細(xì)胞破碎步驟的第一種實(shí)施方式為：瞬間(一般為1秒以內(nèi))改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力，例如，可瞬間提升至2000磅／平方英寸(Psi)再瞬間降至常壓，以使納豆菌細(xì)胞壁破碎，此步驟重復(fù)進(jìn)行，以使納豆菌細(xì)胞充分破碎。
3)離心
用冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于O℃下以2000轉(zhuǎn)／分鐘(rpm)的速度離心8分鐘，收集上清液，于上清液中加入l0％飽和度的硫酸銨(NH4)2s04沉淀，2000轉(zhuǎn)／分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨至60％的飽和度，2000轉(zhuǎn)／分鐘離心收集沉淀，將沉淀重懸于10毫摩爾濃度、pH值為6的磷酸緩沖液中，2000轉(zhuǎn)／分鐘離心l0分鐘收集上清液，于o℃保存?zhèn)溆谩?div style="height:15px;">
用層析系統(tǒng)將上清液以l0公分／小時(shí)(cm／h)的線速度加入凝膠層析柱中，用10毫摩爾濃度(mM)的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出峰完畢，用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為280納米和260納米進(jìn)行檢測(cè)，收集保留體積為9毫升處的洗脫液，收集液體積為3毫升，此步驟可稱作凝膠層析分離。
將精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽l6小時(shí)后，置于．20℃冰箱下冷凍l2小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí)間為24小時(shí)，即可得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。
用冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于20℃下以l0000轉(zhuǎn)／分鐘的速度離心15分鐘，收集上清液，于上清液中加入40％飽和度的硫酸銨(NI-14)2S04沉淀，10000轉(zhuǎn)／分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨(NH4)2S04至85％的飽和度， 10000轉(zhuǎn)／分鐘離心30分鐘收集沉淀，將沉淀重懸于100毫摩爾濃度、pH值為8的磷酸緩沖液中，10000轉(zhuǎn)／分鐘離心收集上清液，于20℃保存?zhèn)溆谩?div style="height:15px;">
