實驗一 人類體細胞染色體標本制備與核型分析
Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype
【實驗目的】
1． 熟悉人類外周血淋巴細胞的培養(yǎng)方法及染色體標本的制備方法。
2． 熟悉人類染色體G顯帶標本制備與分析。
【實驗原理】
染色體是在顯微鏡下可見細胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結構。因此，必須獲得染色體標本才能進行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細胞進行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時細胞進入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進行核型分析。上述制備的染色體標本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋——帶，表明每條染色體的特征。
【實驗用品】
1．采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風機、托盤天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號筆、玻片架、火柴、10ml注射器。
2．RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。
3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉。
【實驗步驟】
一．外周血淋巴細胞染色體標本制備與分析
1. 采血及接種培養(yǎng)
1.1 在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤至管壁。
1.2 常規(guī)消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉(zhuǎn)動注射器使血液與肝素混勻。
1.3 在超凈工作臺中，預先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號針頭），水平搖動混勻。
1.4 置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物1～2次，使血液均勻懸浮，再繼續(xù)培養(yǎng)。
1.5 終止培養(yǎng)前2～4小時，加入秋水仙素，使終濃度達到0.2μg/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。
2．制片
2.1 收集細胞時，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。
2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）。
2.3 棄上清液，加入37℃預溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細胞團混勻后，置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。
2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。
2.5 棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細胞團制成細胞懸液后，室溫下固定20分鐘。
2.6 1000 rpm離心 8分鐘。
2.7 棄上清液，重復固定一次。
2.8 棄上清液，根據(jù)細胞數(shù)量的多少適當加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細胞制成懸液。
2.9 吸取少量細胞懸液，滴2～3滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，氣干。
2.10 將標本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。
2.11 顯微鏡下觀察染色體標本分裂相的多少及分散情況。
二．人外周血淋巴細胞染色體G顯帶標本制備與分析
1. G顯帶染色體標本制備
1.1 常規(guī)制片后，將標本置70℃烤箱中干烤2小時，自然冷卻。
1.2 取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理鹽水，用 1N HCl或1N NaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（PH6.8～7.2），置 37OC預溫。
1.3 將玻片標本放入胰酶溶液中處理25～45秒鐘，不斷輕輕搖動玻片，使胰酶作用均勻。隨著處理標本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時間逐漸延長。
1.4 取出染色體玻片標本，置于37℃預溫的生理鹽水中，然后用蒸餾水沖洗玻片（或輕甩，除去多余的胰酶）。
1.5 將玻片標本放入37℃預溫的Giemsa染液中，染色5～10分鐘。
1.6 自來水沖洗，氣干。
1.7 顯微鏡觀察。
【實驗結果與分析】
一. 常規(guī)染色體核型分析
1．根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲粒的位置，將染色體分為七組。
A組染色體：包括1～3號染色體。長度最長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。
B組染色體：包括4～5號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。
C組染色體：包括6～12號和X染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。
D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著絲粒和隨體。
E組染色體：包括16～18號染色體，16號染色體著絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著絲粒約在 1/4處。
F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。
G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，為近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。
2．繪圖：繪出在顯微鏡下觀察到的染色體。
二．G顯帶染色體標本分析
G帶顯示的正常人顯帶核型特征（見附圖1.1、1.2、1.3）
A組染色體：包括1～3號染色體。長度最長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。
1號染色體
短臂：在320條帶左右的分裂相上，近側段有兩條深帶，第2條深帶稍寬；在處理好的標本上，遠側段可顯出34條淺染的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側的第1深帶為2區(qū)1帶，第2深帶為3區(qū)1帶。
長臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色深淺不一，其遠側為一寬的淺帶，近中段與遠側段各有兩條深帶，中段兩條深帶稍靠近，其中第2條染色較濃。此臂分為四個區(qū)，副縊痕遠側的淺帶為2區(qū)1帶，中段第2深帶為3區(qū)1帶，遠側段第1深帶為4區(qū)1帶。
2號染色體
短臂可見四條深帶，中段的兩條深帶較靠近。此臂分為2個區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2區(qū) 1帶。
長臂：有 7條深帶，第 3和第4深帶有時融合。此臂分為 3個區(qū)．第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。
3號染色體
著絲粒區(qū)濃染
短臂：在近側段可見一條較寬的深帶，遠側段可見兩條深帶，其中遠側的一條較窄，且著色較淺，這是區(qū)別3號染色體短臂的重要特征。近側段的深帶可分為兩條深帶。此臂分2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。
長臂：一般在近側和遠側段各有一條較寬的深帶。在顯帶好的標本上，近側段的深帶可分為兩條深帶，遠側段的深帶可分為三條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。
B組染色體：包括4～5號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。
4號染色體
短臂：可見兩條深帶，近側深帶染色較淺，短臂只有一個區(qū)。
長臂：可見均勻分布的四條深帶，在顯帶較好的標本上，遠側段的兩條深帶可各自再分為兩條較寬的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側段第1和第2深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，遠側段的兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。
5號染色體
短臂：可見兩條深帶，其中遠側的深帶寬而且色濃，短臂只有一個區(qū)。
長臂：近側段有兩條深帶，染色較淺，有時不明顯；中段可見三條深帶，染色較深，有時融合成一條寬的深帶；遠側段可見二條深帶，近末端的一條著色較濃。此臂可分為3個區(qū)，中段第 2深帶為 2區(qū)1帶，中段深帶與遠側段深帶之間的寬闊的淺帶為 3區(qū) 1帶。
C組染色體：包括6～12號和X染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。
6號染色體
短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，其中近側段和遠側段各有一條深帶，近側深帶緊貼著絲粒；在顯帶較好的標本上，遠側段的深帶又可分為兩條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1帶。
長臂：可見五條深帶，其中近側的一條緊貼著絲粒，遠側段末端的一條深帶著色較淺。此臂分為2個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。
7號染色體
著絲粒濃染。
短臂：有三條深帶，中段深帶著色較淡，有時不明顯；遠側深帶著色濃寬，狀如”瓶蓋”。此臂分為2個區(qū)，遠側段的淺帶為2區(qū)1帶。
長臂：有三條明顯的深帶，遠側近末端的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個區(qū)，近側第1深帶為2區(qū)二帶，中段的第2深帶為3區(qū)1帶。
8號染色體
短臂：有兩條深帶，中段有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區(qū)分的主要特征。此臂分為2個區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。
長臂：可見三條分界不明顯的深帶，遠側段的深帶著色較濃。此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。
9號染色體
著絲粒濃染。
短臂：近側段和中段各有一條帶，在顯帶較好的標本上，中段可見兩條窄的深帶，此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。
長臂：可見明顯的兩條深帶，副縊痕一般不著色，在有些標本上顯現(xiàn)出特有狹長的頸部區(qū)。此臂分為 3個區(qū)，近側的一條深帶為2區(qū) 1帶，遠出的一條深帶為3區(qū)二帶。
10號染色體
著絲粒濃染。
短臂：近出段和中段各有一條深帶，在有些標本的中段可見兩條深帶，但與8號染色體短行比較，其深帶的分界不夠清晰。此臀只有一個區(qū)。
長臂：可見明顯的三條帶，近側的深帶較明顯，遠側的兩條深帶較靠近，這是與8號染色體相鑒別的主要特征。此管分為2個區(qū)，近側段的一條深帶為2區(qū)1帶。
11號染色體
短臂：近中段可見兩條靠的很近的較窄的深帶．在顯帶較差的標本上，只能看見一條寬帶。此臂只有1個區(qū)。
長臂：近側有一條深帶，緊貼著絲粒．遠側段可見一條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側的深帶之間是一條寬闊的淺帶，這是與12號染色體相鑒別的一個明顯特征；在顯帶較好的標本上，遠側段的深帶可分為兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，一般極難辨認，但它是一個分區(qū)的界標，在有些標本上近末端處還可見一條窄的淡色的深帶。此臂分為2個區(qū)，上述遠側兩條深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。
12號染色體
短臂：中段可見一條深帶。此臂只有1個區(qū)。
長臂：近側有一條深帶，緊貼著絲粒；中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體相比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個主要特征；在顯帶好的標本上，中段較寬的深帶可分為三條深帶，其正中的一條著色較濃；在有些標本上，遠側段的近端還可見1～2條染色較淡的深帶。此行分為2個區(qū)，中段正中的深帶為2區(qū)1帶。
X染色體
其長度介于7號和8號染色體之間。
短臂：中段有一條明顯的深帶，如竹節(jié)狀。在有些標本上，遠側段還可見一條窄的、著色淡的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。
長臂：可見4～5條深帶，近中部的一條深帶最明顯。此臂分為2個區(qū)，近中段的深帶2區(qū)1帶。
D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著絲粒和隨體。
13號染色體
著絲粒濃染。
長臂：可見4條深帶，第1和第4帶較窄，染色較淡。第2和第3深帶較寬，染色較濃，此臂分為3個區(qū)，第2深帶為2區(qū)1帶，第3深帶為3區(qū)1帶。
14號染色體
著絲粒濃染。
長臂：近側和遠側各有一條明顯的深帶，在處理好的標本上，中段尚可見一條較淺的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側深帶為2區(qū)1帶，遠側深帶為3區(qū)1帶。
15號染色體
著絲粒濃染。
長臂：中段有一條明顯的深帶，染色較濃，有的標本上，近側段可見l～2條淡染的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。
E組染色體：包括 16～18號染色體，16號染色體著絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著絲粒約在 1/4處。
16號染色體
短臂：中段有一條深帶，較好的標本上可見兩條深帶。此臂只有1個區(qū)。
長臂：中段和遠側各有一條深帶，有時遠側段的一條不明顯，副縊痕著色濃。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。
17號染色體
短臂：有一條深帶，緊貼著絲粒。此臂只有1個區(qū)。
長臂：遠側段可見一條深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個區(qū)，這條明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。
18號染色體
短臂：有一條窄的深帶。此臂只有1個區(qū)。
長臂：近側和遠側各有一條明顯的深帶。此臂分為2個區(qū)，兩深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。
F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。
19號染色體
著絲粒及周圍為深帶，其余為淺帶。短臂和長臂均只有1個區(qū)。
20號染色體
著絲粒區(qū)濃染。
短臂：有一條明顯的深帶。此臂只有1個區(qū)。
長臂：在中段和遠側段可見1—2條染色較淺的深帶，有時全為淺帶。此管只有1個區(qū)。
G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，具近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。
21號染色體
著絲粒區(qū)著色淺。
與22號染色體相比較，其長度比22號短。其長臂近側有一明顯而寬的深帶。此臂分為2個區(qū)，其深帶為2區(qū)1帶。
22號染色體
著絲粒區(qū)染色濃。
與21號染色體相比較，其長度比21號長；在長臂上可見兩條深帶，近側的一條著色較濃而且緊貼著絲粒，近中段的一條著色淺，在有的標本上不顯現(xiàn)。此臂只有1個區(qū)。
Y染色體
長度變化較大，有時整個長臂被染色成深帶。在染色較好的標本上，可見兩條深帶。此臂只有1個區(qū)。
圖1.1 G顯帶染色體核型
圖1.2 G顯帶染色體核型分析
圖1.3 正常男性G顯帶染色體模式圖
【注意的問題】
1．采血時不要加入太多的肝素，因為肝素含量過多時往往抑制淋巴細胞的轉(zhuǎn)化。
2．培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液逐漸變黃色，說明pH發(fā)生了較大變化，將不利于細胞生長，此時可加入適量滅菌的1.4% NaHCO3溶液調(diào)整，或再加入2～3ml培養(yǎng)液的辦法來校正。
3．培養(yǎng)失敗的原因，一般有下述幾種：①培養(yǎng)瓶及器材洗滌不符合要求；②配制溶液的雙蒸水不符合要求；③PHA和培養(yǎng)液的質(zhì)量有問題，或培養(yǎng)液pH不符合要求；④無菌操作不符合要求，發(fā)生污染；⑤淋巴細胞對PHA反應降低，致分裂相太少。
4．標本質(zhì)量不佳的原因：①秋水仙素的處理不當，如秋水仙素的濃度不夠或處理時間不足，結果分裂相太少；如濃度過高或處理時間過長，則使染色體過于縮短，難于進行分析；②低滲處理不當，低滲處理時間過長時，細胞膜往往過早破裂，染色體丟失；如果低滲處理不夠，則染色體分散不佳，難以進行計數(shù)分析；③離心速度不合適，收集細胞時離心的速度太低易丟失細胞，如果低滲后離心速度過高，往往使分裂相過早破裂，完整的分裂相減少；④標本固定不充分，如固定液不新鮮，或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，結果染色體模糊，或殘留胞漿痕跡，使背景不清；⑤玻片去污不徹底，冷凍不夠，使細胞懸液不能均勻附著以致細胞大量丟失，或染色體分散不佳。
5．制備G顯帶染色體標本時，要嚴格控制胰酶消化時間，時間不足顯不出帶紋，時間過長，使染色體不規(guī)則或形成空泡狀。
附 錄
一、試劑及配制：
1、RPMI1640培養(yǎng)液
RPMI1640 10.4g
肝素 80mg
PHA 182mg
胎牛血清 100ml
抗菌素 8萬單位
NaHCO3 2g
雙蒸水定容至1000ml。
抽濾除菌，分裝，-200C保存待用。
2、低滲液（0.075Mol KCl）
KCl 2.794 g
三蒸水 500ml
3、固定液
甲醇（AR）：冰醋酸（AR）=3：1 現(xiàn)用現(xiàn)配。
4、Giemsa染液
貯存液
Giemsa 5g
純甘油（AR） 330ml
甲醇 （AR） 33ml
先將Giemsa粉劑溶于少量的甘油中，在研缽中充分研磨至無顆粒粘糊狀，再將全部甘油加入，然后移至燒杯中，在55～60OC溫箱中放置2小時，冷卻后加入甲醇，充分攪拌均勻，在室溫放置2～3周后過濾除去絮狀物，儲存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。
使用液
磷酸緩沖液甲、乙各2.5ml，加45ml雙蒸水，加Giemsa原液2.5ml。
5、2.5%胰蛋白酶原液
胰蛋白酶粉劑 2.5g
生理鹽水 100ml
6、秋水仙素（10mg/ml，使用液100μg/ml）
秋水仙素 1g
生理鹽水 100ml 抽濾，4OC棕色瓶保存。
7、肝素（2500U/ml，使用濃度50U/ml）
肝素鈉 312.5 mg
生理鹽水 100ml 高壓滅菌。
8、Hanks液（g/L）
NaCl 8.00
KCl 0.40
CaCl2 0.14
MgSO4•7H2O 0.20
Na2HPO4 0.06
KH2PO4 0.06
NaHCO3 0.35
葡萄糖 1.00
酚紅 0.02
二、記錄和檢查回報表
表1 染色體病病例檢查分析記錄
送檢材料： 檢查目的： 送檢時間：
編 號： 送 檢 者： 院 科 醫(yī)生
患者姓名： 性 別： 年 齡：
臨床檢查摘要于臨床初步診斷：
家系資料：
表2 染色體檢查記錄
（記錄內(nèi)容：顯微鏡號、標本號、座標、核型與異常特點）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
37
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
48
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
表3 染色體畸變分析記錄
玻片號
性別號
座 標
核 型
畸變?nèi)旧w特點
照片編號
討 論：
分析結果： 分析者：
年 月 日
表4 核型分析
1 2 3 4 5
A B
6 7 8 9 10 11 12 X
C
13 14 15 16 17 18
D E
19 20 21 22 Y
F G
表5核型分析檢查回報單
姓 名
性 別
年 齡
送檢材料
送檢目的
時 間
編 號
送檢者
院 科 醫(yī)生
臨 床 初
步 診 斷
細 胞 遺
傳 學 檢
查 結 果
（1）X染色質(zhì)檢查 Y染色質(zhì)檢查
（2）核型分析
（3）皮膚文理特征
（4）家系分析
診 斷
檢查者 簽字
年 月 日
實驗二 X和Y染色質(zhì)標本的制作與觀察
X and Y Chromatin Preparation and Observation
【實驗目的】
熟悉X染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的形態(tài)特征及其檢查方法
【實驗原理】
正常女性核型為46，XX。在間期細胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)，這是女性細胞中一條X染色體隨機Lyon化失活形成的。這種失活保證了雌雄兩性細胞中都只有一條有活性的染色體，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。稱為X染色體的劑量補償（參考Lyon假說）。
正常男性核型為46，XY。在男性間期細胞核中，可見位于細胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.25～0.3μm。是Y染色體長臂特異性著色而形成。
人的性別是由X和Y染色體決定的。需要對人的性別進行鑒定時，除進行染色體核型分析和臨床生殖器官的檢查外，還可以通過細胞學方法，如檢查期間體細胞（口腔上皮，皮膚，羊水和血細胞等）的核內(nèi)染色質(zhì)——X和Y染色質(zhì)來鑒定。
【實驗用品】
顯微鏡、熒光顯微鏡、乙醇(無水乙醇,95％,70％、50％)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1％結晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦鏡紙、蓋玻片、載片、15ml刻度離心管、牙簽、吸水紙、小鑷子、碘酒、酒精棉球、采血針、3％醋酸溶液、pH6～6.5緩沖液、0.5％鹽酸阿的平染液。
（注：硫堇染液(工作液)，①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后過濾備用；②醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉·3H2O 9.7g，巴比妥鈉14.7g，溶于500mL蒸餾水中；③0.1 mol／L鹽酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，調(diào)pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。）
【實驗步驟】
一、X染色質(zhì)的制備和觀察
（一）取材
1. 讓受檢者用水漱洗口腔數(shù)次，以盡量除去口腔內(nèi)細菌或其它雜物。
2. 用牙簽鈍頭部或木質(zhì)器具刮取口內(nèi)側面的口腔粘膜上皮，棄去第一次刮到的細胞。
3. 同一部位連續(xù)刮取數(shù)次，將刮取物涮入裝有生理鹽水的離心管內(nèi)。
（二）標本的制作
1. 將細胞懸液的離心管進行離心（1 500 rpm）10分鐘，去上清液，留下細胞團。
2. 加入新配制的固定液（3份甲醇︰1份冰醋酸）8mL，混勻呈懸液。固定30分鐘。
3. 離心（同上），去上清液，留下細胞團。
4. 加入數(shù)滴（根據(jù)細胞多少而增減）固定液，充分混勻呈懸液。
5. 滴一滴懸液至預先置冰盒中的干凈載玻片上，晾干。每份樣本制片3—4張。
（三）染色
Klinger硫堇染色法
1. 將玻片標本置入1mol/L HCl中，37℃條件下水解20分鐘。
2. 用蒸餾水充分沖洗、晾干。
3. 硫堇染液中染色約15分鐘。
4. 蒸餾水沖洗、晾干。
硫堇染色的優(yōu)點是只有細胞核清晰著色，胞漿不著色，因此細胞核背景清晰，利于對位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認。
結晶紫的染色法
1. 固定后的玻片標本經(jīng)過70％、50％酒精及蒸餾水（更換兩次蒸餾水）各5分鐘。
2. 置入1％結晶紫溶液中染色5～8分鐘。大量制片時可用0.5％結晶紫染液，染色10～15分鐘左右。
3. 95％酒精中分化（快速地在酒精中沾5～8次）。
4. 繼續(xù)在無水乙醇中分化，間歇地用顯微鏡檢查，直至標本中核結構的微細部分都很清楚為止（一般約1分鐘）。
5. 置入二甲苯中。更換2次二甲苯，每次3分鐘，以使標本透明。
6. 樹膠封片。
（四）觀察
1.先在低倍鏡(10倍鏡)下觀察，可見視野中有許多單個或成堆的口腔上皮細胞。選擇清楚而分散的細胞，移至視野中央，再換高倍鏡仔細觀察?？谇簧掀ぜ毎麨槎噙呅蔚谋馄綘睿毎醒胗幸槐蝗境缮钐m色的圓形或橢圓形的細胞核。核周圍均質(zhì)部分為細胞質(zhì)。細胞的外表為一很難與細胞質(zhì)相區(qū)別的薄膜即細胞膜。
2. 40倍或油鏡下檢查100個“可計數(shù)細胞”，并計數(shù)具有X染色質(zhì)的細胞數(shù)。
二、Y染色質(zhì)的制片與觀察
（一）制作標本
1. 采血與涂片：男同學用碘酒，酒精棉球常規(guī)消毒食指或耳垂后，用采血針點刺食指或尖或耳垂，擠出2～3滴血于一干凈的底玻片中央，用牙簽將血滴涂成較厚的一層血膜，直徑約1.5cm，晾干。
2. 固定：加3％的醋酸溶液數(shù)滴于血膜上，靜置15分鐘，其間可換液一次，使紅細胞溶解。
3. 用pH6～6.5磷酸緩沖液沖洗血膜，晾干。
4. 染色：加0.5％鹽酸阿的平溶液數(shù)滴于血膜上，放置暗處靜置染色15分鐘。（若使用口服阿的平片劑，則用100mg溶于10ml雙蒸水中，染色時間為25分鐘）。
5. 再用磷酸緩沖液沖洗黃色溶液。
6. 加蓋玻片，在有緩沖液的情況下，用熒光顯微鏡進行觀察。
（二）觀察Y染色質(zhì)
先在低倍鏡下觀察，可見許多白細胞（多為淋巴細胞）核染成黃色。換高倍鏡，可見位于細胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.25～0.3μm。最后可用油鏡再仔細觀察。Y染色質(zhì)在男性白細胞的出現(xiàn)率可達60～70％。注意需要計數(shù)的細胞必須是核膜完整無缺，核質(zhì)染色均勻，清晰可見，核周圍無細菌和其它污染物質(zhì)的干擾。
【實驗結果與分析】
觀察并計算X染色質(zhì)的陽性率。X染色質(zhì)的標準是：
1. 位于核膜內(nèi)緣。
2. 核內(nèi)唯一的濃染、輪廓清楚的小體，直徑約為1～1.5μm,一般呈平凸形、圓形、扁平形或三角形。
(注：配制的pH6～6.5的磷酸緩沖液要用黑紙或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一個月。)
實驗三 姊妹染色單體交換實驗
Sister Chromosome Exchange （SCE）
【實驗目的】
熟悉制備SCE標本的原理和基本程序。
【實驗原理】
姊妹染色單體交換（Sister chromatial exchange,SCE）是染色體同源座位上復制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類特殊的同源重組，主要在DNA合成期形成，可能與DNA雙鏈的斷裂與復制有關，SCE的發(fā)生的頻率可反映細胞在S期的受損程度。如果一個個體的SCE率明顯增高，可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響，或是受到遺傳缺陷的內(nèi)在制約因素所致。
在細胞分裂時，每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNA組成。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy- uridine，BrdU）是脫氧胸腺嘧啶核苷的類似物，在DNA鏈的復制過程中，可替代胸腺嘧啶。當細胞生存環(huán)境中存在BrdU時，BrdU取代脫氧胸苷摻入到復制的DNA中。經(jīng)兩個復制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNA的雙鏈均有BrdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BrdU摻入。利用特殊的分化染色技術對染色體標本進行處理，可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrdU的單體深染。當姊妹染色體間存在同源片段交換時，可根據(jù)每條單體夾雜著深淺不一的著色片段加以區(qū)分。由于姐妹染色單體的DNA序列相同，SCE并不改變遺傳物質(zhì)組成，但SCE是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的，因此，SCE顯示方法通常用來檢測染色體斷裂頻率，用來研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應。
【實驗用品】
1. 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、冰箱、離心機、顯微鏡、采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、膠塞、乳頭吸管、試管架、載玻片、托盤天平、干燥烤箱、染色缸、電吹風、30W紫外燈。
2. 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清、秋水仙素（100μg/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200μg/mL）、低滲液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸。
【實驗步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。
2. 37℃培養(yǎng)24小時后，加BrdU溶液（終濃度為8μg/mL）混勻。
3. 用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
4. 收獲前加入秋水仙素（終濃度為0.2μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)1小時。
5. 常規(guī)法制片。將玻片標本室溫放置2～3天。
6. 分化染色前一天，將標本置37℃過夜。
7. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片放在牙簽上，加適量2×SSC溶液（以不超過標本為度）。在標本上蓋一張比玻片稍大的擦鏡紙，使紙邊浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液滲至玻片標本上，保持標本濕潤。
8. 將平皿置55℃水浴面上，用30W紫外燈垂直照射標本30分鐘，照射距離10cm。
9. 照射后輕輕取掉擦鏡紙，立即用蒸餾水沖洗標本。
10. Giemsa染色5～10分鐘；蒸餾水沖洗標本，氣干。
11. 鏡檢，計數(shù)。
每個末端交換記為1次SCE，中部交換記為2次SCE。
【實驗結果與分析】
觀察30個細胞的分裂相，記錄每個細胞的SCE總數(shù)，計算SCE頻率。
n個中期分裂相SCE之和
SCE頻率=
n個細胞
中國人正常SCE頻率為5.7±0.4。
實驗四 銀染核仁形成區(qū)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合
AgNO3 Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome
【實驗目的】
熟悉銀染的原理和方法。
【實驗原理】
人類近端著絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關，故稱為核仁形成區(qū)（NOR）。當位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因（rDNA）具有轉(zhuǎn)錄活性時，應用銀染技術可使NOR特異性著色（褐黑色）。進一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。人類核糖體RNA基因位于5對近端著絲點染色體短臂的次猛痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中， 不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10。應用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA基因的活動。此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，應用銀染技術可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此，應用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合（Ag-AA）技術，可以分析有活性的rRNA基因的動態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細胞。
【實驗用品】
1. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子；
2. 預制染色體玻片標本、0.1％甲酸、AgNO3（50％）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。
【實驗步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標本在室溫下放置2～3天。
2. 將標本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘，蒸餾水沖洗2-3次，甩干。
3． 將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1％甲酸溶液中，混勻后立即滴4～5（5ml）滴至玻片標本上。
4. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片標本放在牙簽上。
5. 在標本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙，用鑷子掀動紙片數(shù)次，使染液均勻分散在標本上。
6. 將平皿置于60℃水浴箱中處理3-5分鐘，直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應。
7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙，以1：20 Giemsa染液復染3分鐘。水洗，氣干。
8. 鏡下觀察。
【實驗結果與分析】
1. Ag-NOR的計數(shù)：選擇銀染著色清晰的分裂相，計數(shù)6個D組（13、14、和15號染色體）和4個G組（21和22號染色體）近端著絲粒染色體，不論單側或雙側的銀染點都計數(shù)為一個有銀染的染色體。
2. Ag-AA計數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的，均計數(shù)為Ag-AA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，記為1個Ag-AA；涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的，記為2個Ag-AA；3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時，記為3個Ag-AA；依此類推。
N個核型中含NOR染色體數(shù)之和
NOR均值=
N個核型
（注：避免AgNO3 溶液污染皮膚，否則將其染成褐黑色，很難洗掉。）
實驗五 核酸提取
The Extraction of Nucleic Acid
【實驗目的】
1．掌握核酸提取的基本原理和基本方法
2．掌握檢測核酸濃度及純度的原理及方法
【實驗原理】
DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學研究的主要對象,因此DNA的提取也應是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進行分子生物學方面的實驗。在DNA提取過程中應做到：1、根據(jù)不同研究需要，保證結構的相應完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。
核酸的提取關鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提，在單價陽離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量時，應在260nm和280nm兩個波長下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計算樣品中的核酸濃度，OD值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA及大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0，如果樣品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值，此時無法對樣品中的核酸進行精確定量。
【實驗用品】
1．臺式離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計；一次性塑料手套。
2．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。
3．DNA提取的相關試劑：
1）蛋白酶K（10mg/ml）,-20℃保存。
2）TE（pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）, 15磅高壓滅菌后室溫保存。
3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加熱68℃助溶，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加蒸餾水定容至100ml，室溫保存。
4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。
5）飽和氯化鈉，70%乙醇，氯仿
6）飽和酚
【實驗步驟】
飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA
1．取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；
2．室溫離心，10000rpm ，1分鐘；
3．棄上清，加入0.4ml TE(pH 8.0)，混勻，懸浮細胞；
4．加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）,10% SDS 25μl(終濃度0.5%)，混勻；
5．37℃水浴消化過夜，或50℃消化4小時；
6．加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4℃靜置10分鐘；
7．10000rpm離心10分鐘，取上清于另一新管中；
8．加入等體積氯仿，混勻，10000rpm離心10分鐘；
9．取上清于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；
10．加入2倍體積無水乙醇輕輕混合，10000rpm離心1分鐘；
11．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
12．10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然干燥DNA約5分鐘；
13．加入200-250μl TE，-20℃保存；
14．檢測濃度及純度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1．外周血反復凍溶破壞紅細胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混勻后，10000rpm 離心10分鐘；
2．棄上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）混勻；
3．37℃水浴消化過夜，或50℃消化4小時；
4．加入等體積的飽和酚并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
5．吸取上清液于另一新管中，重復上一步驟一次；
6．吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
7．吸取上清液于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后，加入2倍體積無水乙醇并輕輕混合，可見絮狀乳白色DNA團塊，10000rpm離心10分鐘；
8．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
9. 10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TE液，-20℃保存；
10．檢測濃度及純度
組織總RNA的提取
1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min，擊碎后回收入2ml無菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進行組織勻漿,樣品體積不應超過TRIZOL試劑體積的10%；
2.將組織勻漿液在15-30℃放置5min,促使核蛋白復合物完全解離,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30℃放置10min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心10min；
4. 棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過7500g,離心5min；
5. 室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃溫浴10min).
6. 紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度；
7. 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，每孔上樣25μg，65V，2.5h，以檢測RNA的質(zhì)量。
【實驗結果分析】
1. 計算已提取的DNA的濃度和純度
【思考題】
1．DNA提取還有哪些方法？
2．RNA提取中關鍵問題是什么？
實驗六 DNA重組技術
Recombinant DNA
【實驗目的】
1．掌握DNA重組技術的基本原理和基本方法
2．熟悉質(zhì)粒DNA的小量制備及酶切鑒定方法
【實驗原理】
1．DNA重組技術
重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟：
1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設計一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。
2）將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細胞。
3）克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細菌能在培養(yǎng)基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細菌。
4）收獲擴增后的培養(yǎng)細胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。
圖2.1 TA克隆原理示意圖
圖2.2 克隆選擇增殖原理示意圖
2．質(zhì)粒DNA的小量制備
常見的質(zhì)粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH 12.0~12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。
3．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）切分析
限制酶存在于原核生物體內(nèi)，根據(jù)其結構和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點不固定，Ⅲ型其切割位點在識別位點之外，只有Ⅱ型其特異性切點位置可以控制和預測，可以產(chǎn)生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DNA雙鏈，形成一定長度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對重組的環(huán)狀質(zhì)粒進行酶切，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用已知相對分子量的線狀DNA（DNA分子量標志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對照，可以對重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的DNA分子進行初步鑒定。
【實驗用品】
1．PCR擴增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀； 電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動成像儀。
2．三角燒瓶（500ml, 250ml,100ml）,培養(yǎng)皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。
3．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。
4．DNA重組相關試劑：
1）Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：pMD18-T；感受態(tài)細菌；氨芐青霉素（100mg/ml）。
2）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，10N NaOH調(diào)pH至7.0定容至1L。15磅高壓消毒，4℃保存。
3）LB瓊脂培養(yǎng)基：15g瓊脂粉溶于1000ml LB培養(yǎng)基，15磅高壓消毒備用。
5．質(zhì)粒提取試劑：
溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高壓消毒，4℃保存?zhèn)溆?
溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室溫貯存，即用即配。
溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高壓消毒,室溫貯存。
RNA酶 A: 10mg/ml
TE緩沖液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)
6．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關試劑：
限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反應所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10mg/ml）；6×載樣緩沖液。
Tris-乙酸(TAE)貯存液：
50×：242克Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
加水至1L
【實驗步驟】
1．PCR產(chǎn)物純化
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。
2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建
反應體系及條件如下：
PMD18-T Vector （50ng/μl） 1μl
目的DNA（5ng/μl） 4μl
連接液Ⅰ 5μl
10μl
16℃連接過夜。
圖2.3 pMD18-T載體
3．轉(zhuǎn)化
3.1 將感受態(tài)細胞置冰中融解。
3.2 將60μl感受態(tài)細胞移至無菌試管內(nèi)。
3.3 加入用于轉(zhuǎn)化的DNA 10μl（＜10ng），輕彈管底混勻。
3.4 冰中放置30分鐘。
3.5 42℃放置45~60秒，不要振蕩。
3.6 冰中放置2~3分鐘。
3.7 加入37℃ 預溫好的LB培養(yǎng)基940μl（無抗生素）。
3.8 37℃振蕩培養(yǎng)1小時（160~225 rpm）。
4．篩選及增菌
4.1 取適量涂布瓊脂平板。
4.2 37℃培養(yǎng)過夜。
4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液體培養(yǎng)基中（含50μg/ml Amp）過夜培養(yǎng)（240 rpm）。
4.4 收集細菌，提取質(zhì)粒。
5．質(zhì)粒DNA提取
5.1 2ml 菌液以12000rpm離心1分鐘。
5.2 棄上清，沉淀物溶于100μl溶液Ⅰ（1×）中，劇烈振蕩，室溫5分鐘。
5.3 加新配制的溶液Ⅱ200μl，充分混合后冰浴5分鐘。
5.4 加溶液Ⅲ 150μl，混勻冰浴5分鐘。
5.5 12000rpm離心10分鐘,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
5.6 加900μl（2倍體積）的乙醇，震蕩混合,室溫放置2分鐘，沉淀雙鏈DNA。
5.7 12000rpm離心5分鐘。
5.8 小心吸去上清液,將離心管倒置于一張紙巾上,以使所有液體流出.再將附于管壁的液滴除盡。
5.9 用1ml 70%乙醇洗滌沉淀的雙鏈DNA,按“步驟5.8”所述方法去掉上清,在空氣中使沉淀的DNA干燥10分鐘。
5.10 用50μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸,振蕩,貯存于-20℃。
6．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定
6.1 質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切
將清潔、干燥、滅菌的Eppendorff管（0.5ml）編號，用微量加樣器按表1所示將各種試劑分別加入每個管內(nèi)。
表1 質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切加樣表
編號
試劑
1（實驗組）
2（對照組）
酶反應所需緩沖液
2μl
2μl
0.1%BSA
1μl
1μl
限制性酶Hind Ⅲ
1μl
限制性酶XbalⅠ
1μl
質(zhì)粒DNA
8μl
8μl
無菌去離子水
7μl
9μl
總體積
20μl
20μl
加樣后，小心混勻，置于37℃水浴消化過夜，然后65℃ 20分鐘終止酶解反應。各酶切樣品于-20℃貯存?zhèn)溆谩?div style="height:15px;">
取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
稱取0.6克瓊脂糖，置于錐形瓶內(nèi)，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到1.2 %瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ml），使溴化乙啶終濃度為0.5μg/ml。小心混勻并倒在有機玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預電泳10分鐘。
取出凝膠，在波長為254 nm的紫外燈下觀察凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或采用有機玻璃防護罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。
聚合酶鏈式反應（PCR）是模擬體內(nèi)DNA復制條件在體外酶促合成特異DNA片段的循環(huán)反應，可使目的DNA片段得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置于高溫(約93℃-95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫(約50℃-70℃)下分別與目的DNA片段兩側的互補序列復性結合；引物在DNA聚合酶作用（約70℃-75℃）下沿模板按5’→3’方向延伸，合成目的DNA片段的新互補鏈。如此經(jīng)過n個周期，理論上擴增2n倍,一般PCR經(jīng)30-40周期后可獲得百萬倍以上的目的DNA。
聚合酶鏈式反應—限制性片段長度多態(tài)（PCR—RFLP）分析技術是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上，使酶切位點增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應用PCR—RFLP，可檢測某一致病基因已知的點突變，進行直接基因診斷，也可以此為遺傳標記進行連鎖分析進行間接基因診斷。
本實驗以家族性甲型血友病患者及其相關成員外周血DNA為模板，PCR擴增凝血因子FⅧ基因的583bp特異片段產(chǎn)物，其中包含MspⅠRFLP多態(tài)位點，經(jīng)MspⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測等位片段的長度（583bp或360bp+223bp），以此為遺傳標記進行連鎖分析，判斷胎兒是否得到了帶有缺陷FⅧ基因的染色體，從而做出間接基因診斷。
1．DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）10×PCR反應緩沖液、dNTP（2.5mM）、滅菌蒸餾水、液體石蠟、限制性內(nèi)切酶MspⅠ（20U/μl）、10×酶切緩沖液。
3．PCR自動熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器（20μl、200μl）、槍頭（20μl、200μl）及離心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封口膜、浮漂、微波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤天平、臺式高速離心機。
按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無菌的0.5ml離心管中。輕輕混勻后，離心5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應混合液的表面，然后放入PCR儀中進行循環(huán)反應。
取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
稱取1克瓊脂糖，置于錐形瓶內(nèi)，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到2%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ml），使溴化乙啶終濃度為0.5μg/ml。小心混勻并倒在有機玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
根據(jù)甲型血友病患者及其相關成員的親屬關系繪制遺傳系譜圖，觀察并記錄瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段長度，繪制出家系各成員FⅧ基因MspⅠ RFLP等位片段與系譜相關圖，進行連鎖分析，判斷胎兒是否是甲型血友病患兒。
現(xiàn)有一名女性已生過一個甲型血友病兒子和一個表型正常的女兒，追問家族史其弟弟也是甲型血友病患者。該女性現(xiàn)妊娠4個月，要求作產(chǎn)前基因診斷。（注：胎兒性別產(chǎn)前基因診斷結果：SRY(+),ZFX/ZFY(+/+)。）
PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的新技術。它是一種簡單、快速、經(jīng)濟的點突變篩查手段。PCR-SSCP技術的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動速率，相同長度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
為了便于觀察分析結果，PCR擴增體系中常加入a-32P dNTP標記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀察泳動帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標記。
單鏈DNA片段的立體構象主要與堿基序列相關，但也受到其他條件的影響。因此，PCR-SSCP技術的關鍵在于電泳時的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
3.1 制備50ml 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加TEMED 25μl、10%過硫酸銨250μl，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入1´TBE電泳緩沖液，緩沖液應高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。
變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發(fā)生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區(qū)的Tm值，此區(qū)便開始熔解，而高熔點區(qū)仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發(fā)生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。
為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區(qū)——GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側引物的5′端加上一個30~40bp的GC結構，這樣在PCR產(chǎn)物的一側可產(chǎn)生一個高熔點區(qū)，使相應的感興趣的序列處于低熔點區(qū)而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。
作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優(yōu)點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內(nèi)即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。
DHPLC技術也稱為WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)。利用高效液相色譜原理，PCR擴增后的DNA片段與緩沖液（TEAA）混合形成液相，流動相被高壓驅(qū)動，通過一個DNA分離柱——DNA Sep柱，該柱可對DNA片段進行分離和分析。變性溫度是影響DNA片段分析的一個重要因素，變性溫度升高，保留時間縮短。洗脫的核苷酸片段經(jīng)檢測器檢測后轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號記錄并儲存于計算機中。
在部分變性條件下，DNA Sep柱可檢測突變。雜合的個體在部分變性條件下（95℃變性后逐漸冷卻到一定溫度）形成純合和雜合雙鏈。兩者通過DNA Sep柱時保留時間不同而得以區(qū)分。
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
