淺論類器官助力奧密克戎研究
知識背景：
2021年11月9日，南非首次從病例樣本中檢測到一種新冠病毒B.1.1.529變異株。短短2周時(shí)間，該變異株即成為南非豪登省的絕對優(yōu)勢變異株，增長迅猛。11月26日，WHO將其定義為第五種“關(guān)切變異株”（ VOC），取名 奧米克戎（奧密克戎），其刺突蛋白中攜帶了超過30個(gè)突變，現(xiàn)在正以迅猛的速度在國際上傳播。
圖1 刺突蛋白德爾塔和奧米克戎的變異結(jié)構(gòu)比較
令人恐懼的是，即使已經(jīng)接種第二針疫苗，但各地仍有多例感染病例出現(xiàn)，這表明奧米克戎很可能對接種疫苗產(chǎn)生的抗體有明顯的逃避作用，那為什么衛(wèi)健委一再宣傳接種第三針的必要性？奧米克戎又為什么令人聞風(fēng)喪膽？它和之前的毒株相比又有什么不同？
你問我答：
自從奧米克戎出現(xiàn)以來，曾因?yàn)楦邆魅韭屎?HIV 的產(chǎn)生背景引起一陣恐慌，但隨著人們對它的研究，發(fā)現(xiàn)奧米克戎具有上呼吸道感染、病情較輕、感染年輕化等特征。來自英國劍橋大學(xué)的研究人員決心研究奧米克戎的相關(guān)發(fā)病機(jī)制，了解為什么這個(gè)變種會突然間爆發(fā)出來？為什么感染特征與之前毒株不相一致？
為什么奧米克戎主要表現(xiàn)為上呼吸道感染？
猜想可能與奧米克戎上的S蛋白突變引起致病機(jī)制的改變有關(guān)，因?yàn)閵W米克戎在n端結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合域上存在20多個(gè)取代基，在S2中也有6個(gè)獨(dú)特的突變，這些取代基和突變很有可能會影響奧米克戎的致病機(jī)制。
首先我們要知道新冠病毒的進(jìn)入細(xì)胞途徑主要有兩種，一種是病毒通過胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞——病毒以網(wǎng)格蛋白依賴性方式與ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）結(jié)合并內(nèi)在化，通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞，再通過蛋白酶(例如Furin蛋白酶)介導(dǎo)S蛋白激活促進(jìn)膜融合，使得病毒的RNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引發(fā)宿主細(xì)胞感染；另外一種是病毒通過與細(xì)胞膜直接融合進(jìn)入宿主細(xì)胞——胞膜融合方式也需要病毒表面S蛋白與細(xì)胞上ACE2受體相結(jié)合，而這種進(jìn)入方式需要輔助結(jié)合因子的參與，目前已知關(guān)系最為密切的是TMPRSS2（跨膜絲氨酸蛋白酶），它能夠協(xié)同激活S蛋白，通過促進(jìn)胞膜融合使得病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。
圖2 SARS CoV-2已知的兩種細(xì)胞進(jìn)入途徑
與之前的毒株相比，奧米克戎進(jìn)入細(xì)胞方式的不同在于選擇更多以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，而這種改變歸因于TMPRSS2對奧米克戎作用減弱，而奧米克戎對ACE2親和力升高，所以奧米克戎對高表達(dá)TMPRSS2的下呼吸道的感染率下降，而低表達(dá)TMPRSS2的上呼吸道感染多見。
為什么低表達(dá)TMPRSS2的上呼吸道易感染？
通過建立類器官模型（下呼吸道、膽囊）和使用常用細(xì)胞系作為研究對象，研究人員發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)TMPRSS2的細(xì)胞中，奧米克戎檢出率較低，而在高表達(dá)ACE2的細(xì)胞中，奧米克戎的檢出率與其他毒株沒有明顯的差異。這意味著這意味著奧米克戎和德爾塔對低表達(dá)TMPRSS2的上呼吸道的易感性相似，而對于高表達(dá)TMPRSS2的細(xì)胞群易感性出現(xiàn)差異，提示TMPRSS2可能在奧米克戎中作為輔助結(jié)合因子的作用變得相當(dāng)有限，最可能的解釋是奧米克戎缺乏多堿基切割位點(diǎn)，使其沒有在生產(chǎn)細(xì)胞中被切割，而是被TMPRSS2或核內(nèi)體中的組織蛋白酶在靶細(xì)胞表面切割，通過降低刺突切割效率，損害TMPRSS2介導(dǎo)的胞膜融合路徑來促進(jìn)胞吞作用，此外還可能與諸多累積的基本氨基酸突變，導(dǎo)致S蛋白總電荷的增加，使S蛋白對低pH誘導(dǎo)的構(gòu)象改變更加敏感，有利于利用上氣道低pH環(huán)境通過胞吞進(jìn)入宿主細(xì)胞。
圖3 各種細(xì)胞復(fù)制率差異比較
黑色（武漢毒株）；橙色（德爾塔）；灰色（奧米克戎）
圖4 下氣道類器官亮場圖像
圖5 膽管細(xì)胞類器官亮場圖像
圖6 類器官入口檢測感染示意圖
除了TMPRSS2因素外，
還有導(dǎo)致易感染的因素嘛？
奧米克戎對ACE2受體的親和力增強(qiáng)約3倍，這可能是相對于其他毒株更加易感染的一個(gè)因素。研究人員利用生物層干涉法測定了人ACE2受體與奧米克戎毒株、武漢毒株和德爾塔毒株親和力的差異，結(jié)果奧米克戎的對ACE2的結(jié)合親和力增強(qiáng)約3倍。為什么會這樣呢？因?yàn)橐淹蛔兊陌被崮軌蚺cACE2上的殘基結(jié)合引入額外的靜電相互作用，也有的突變氨基酸能夠與ACE2形成氫鍵，所以雖然也有突變氨基酸會抑制ACE2結(jié)合，但總體上突變的受體結(jié)合域上的氨基酸增加了奧米克戎對ACE2的親和力。
圖7 刺突蛋白德爾塔和奧米克戎的變異結(jié)構(gòu)
圖8 人ACE2與SARS-CoV-2 VOC結(jié)合的動力學(xué)分析
為什么奧米克戎重癥病人不多？
降低對TMPRSS2的依賴性，不僅意味著好發(fā)感染的部位發(fā)生了改變，而且還意味著毒株致病力的下降。奧米克戎更加傾向于感染上呼吸道，而不是下呼吸道，這使得奧米克戎更加類似于常見的上呼吸道病毒感染性疾病——病毒性感冒，對于重要臟器侵襲的減少是奧米克戎重癥患者少的主要原因。除此之外，奧米克戎的致病力也有所下降，研究人員在半固態(tài)介質(zhì)系統(tǒng)培養(yǎng)被毒株感染的細(xì)胞，結(jié)果顯示與德爾塔相比，奧米克戎的斑塊尺寸更小，較小的病灶可以歸因于病毒進(jìn)入細(xì)胞方式的改變。在體內(nèi)較小的病灶可能意味著良好的預(yù)后，這幫助解釋了為什么奧米克戎的重癥患者很少。
圖9 德爾塔和奧米克戎活病毒形成的感染灶
圖10 培養(yǎng)德爾塔和奧米克戎感染灶大小和數(shù)目差異
疫苗對奧米克戎還管用嗎？
奧米克戎對接種疫苗產(chǎn)生的多克隆中和抗體表現(xiàn)出免疫逃避作用，意味著病毒受體結(jié)合域中I-IV類抗原區(qū)域很可能發(fā)生了突變。研究人員驗(yàn)證了臨床常用治療性單克隆抗體對于治療奧米克戎的有效性，結(jié)果這些單抗對德爾塔有不錯(cuò)的作用，但對奧米克戎，無論是單獨(dú)或聯(lián)合使用單抗，都完全喪失了抗體對奧米克戎的中和作用。
這可能是由于突變的氨基酸阻礙了單抗與奧米克戎的結(jié)合所致的，理論上奧米克戎中突變的氨基酸（K417N, E484A, S477N和Q493R）可以排除與單抗（REGN10933）的結(jié)合，而突變的G446S則與單抗（REGN10987）的結(jié)合相沖突，因此奧米克戎 受體結(jié)合域和S三聚體的結(jié)合減弱以及抗體中和作用損失一致。此外，有研究表明病毒表面S蛋白若出現(xiàn)K417N、E484A或N501Y突變，很可能提示病毒免疫逃逸能力增強(qiáng)，奧米克戎剛剛出現(xiàn)的時(shí)候之所以被預(yù)測具有高致病性和高感染率，就是因?yàn)樵趭W米克戎上檢測到這三種氨基酸突變的存在。
不過奧米克戎對于RNA聚合酶抑制藥物還是無能為力的，相關(guān)藥物能通過抑制RNA聚合酶阻止病毒逆轉(zhuǎn)錄和自我復(fù)制的過程，讓病毒難以自我復(fù)制和繁殖，面對德爾塔和奧米克戎都有不錯(cuò)的抗病毒活性。
圖11 兩種單抗以及聯(lián)合物抗德爾塔和奧米克戎效果滴定
圖12 RNA聚合酶抑制藥物抗德爾塔和奧米克戎的劑量反應(yīng)曲線
既然中和抗體對奧米克戎作用有限，
那還有必要接種疫苗嘛？
當(dāng)然有必要，接種第三針疫苗能夠有效降低感染患者的易感性和重癥率！為了探究疫苗誘導(dǎo)的多克隆中和抗體能否中和奧米克戎，研究人員將40個(gè)接種兩針疫苗的血清樣本與 PV（假型病毒）粒子混合前，進(jìn)行血清滴定，結(jié)果表明與德爾塔相比，第二劑后奧米克戎的中和作用損失10倍以上，而如果使用第三劑疫苗進(jìn)行增強(qiáng)的話，對所有變種均能觀察到中和作用顯著增加。
圖13 第2針疫苗后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對PV的中和作用
圖14 第3針疫苗后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對PV的中和作用
研究意義
①研究發(fā)現(xiàn)第二針疫苗誘導(dǎo)的中和抗體對奧米克戎中和作用有限，而中和作用可以通過接種第三針疫苗大大增強(qiáng)，這對于宣傳第三次疫苗接種工作而言至關(guān)重要，所以看完了快點(diǎn)去打第三針疫苗吧！
②研究發(fā)現(xiàn)臨床常用的單抗對奧米克戎治療效果不佳，但通過RNA聚合酶抑制劑對奧米克戎效果顯著，為臨床藥物治療提供了新的指向。
③研究解釋了奧米克戎在臨床表現(xiàn)上為什么不同于以往毒株，表現(xiàn)為上呼吸道感染、能夠逃避免疫反應(yīng)以及重癥感染少等的原因。
④研究發(fā)現(xiàn)奧米克戎致病機(jī)制以往毒株不同，雖然在入侵細(xì)胞的時(shí)候，依然把ACE2作為重要的受體分子，但不再依賴TMPRSS2作為重要輔助分子且其可能受到ACE2水平不同影響，這意味新冠變異速度非?？?，絕對不能掉以輕心。
結(jié)
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語
研究人員從刺突介導(dǎo)的免疫逃避、ACE2結(jié)合的相互作用和決定組織取向的細(xì)胞進(jìn)入途徑等方面探討了奧米克戎的生物學(xué)特性，通過使用類器官模型和多種培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)，揭示了奧米克戎在細(xì)胞偏好上的差異，這受到很多限制：首先盡管使用的是原代人體組織，但體外培養(yǎng)系統(tǒng)和人體內(nèi)還是有差異的；其次TMPRRS2的水平可能影響ACE2，特別是TMPRSS2與ACE2的裂解有關(guān)，具體效應(yīng)大小受到ACE2表達(dá)的影響；最后特異性蛋白酶抑制劑除了抑制細(xì)胞組織蛋白酶外，還可能抑制病毒蛋白酶，這可能影響觀察到的結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然存在種種遺憾，但研究也為未來的研究方向指出了道路，奧米克戎剛剛出現(xiàn)的時(shí)候，有研究通過檢測病毒表面的氨基酸突變預(yù)測奧米克戎具有高度的傳染性和致病性，但實(shí)際表現(xiàn)中盡管奧米克戎具有較高的傳染性，但是致病性并不強(qiáng)，為什么會出現(xiàn)這樣的偏差？原因尚不得而知，可能與氨基酸突變之間的相互作用有關(guān)，這表明僅基于序列對復(fù)制和趨向性的預(yù)測可能具有誤導(dǎo)性，隨著變異的不斷出現(xiàn)，對趨向性變化的詳細(xì)分子理解至關(guān)重要。
在本研究中，類器官充當(dāng)了一個(gè)再現(xiàn)原始組織形態(tài)特征的體外培養(yǎng)模型，用于在實(shí)驗(yàn)樣本量不足的情況下，擴(kuò)增培養(yǎng)以獲取足夠高質(zhì)量樣本的目的，盡管類器官目前相關(guān)技術(shù)還未成熟，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚未制定頒布，但是已經(jīng)能夠在科研中逐步應(yīng)用研究，并取得了較好的成果，獲得了世界各地科學(xué)家的認(rèn)可，相信在不遠(yuǎn)的未來，類器官技術(shù)將能夠成為新一代成熟的體外培養(yǎng)模型，更多的造福人類的健康！
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文章涉及的參考文獻(xiàn)的獲取方式：
