液體活檢（liquid biopsy）曾被《麻省理工大學(xué)科技評論》評選為“2015年十大突破技術(shù)”，并被 《科學(xué)美國人》評為“2017十大新興技術(shù)”之首。在過去的五年里，液體活檢以其獨特的優(yōu)勢成為腫瘤臨床與研究、創(chuàng)業(yè)者、投資者趨之若鶩的熱點領(lǐng)域。
當(dāng)前，腫瘤液體活檢主要的檢測標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌體等。其中，ctDNA因為獲取容易、進(jìn)入門檻較低，在近年來成為炙手可熱的投資領(lǐng)域，不時出現(xiàn)大額融資消息，尤被業(yè)界寄予厚望；相比之下，CTC因為獲取困難、門檻相對更高，頗有波瀾不驚的一身“佛性”。但是，《自然·醫(yī)學(xué)》（Nature Medicine）近期接連發(fā)布的兩篇重磅研究，或?qū)㈩A(yù)示液體活檢版圖的重構(gòu)。11月25日，《自然·醫(yī)學(xué)》在線發(fā)表了題為《超深度測序揭示血漿cfDNA突變來源》（High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants）的重磅文章，其結(jié)果讓研究者驚訝得“差點掉下椅子”。cfDNA全稱是循環(huán)無細(xì)胞DNA（circulating free DNA），是指游離于血液中的細(xì)胞外DNA，主要來源于衰老、凋亡的血細(xì)胞（如造血細(xì)胞）釋放的片段化DNA。
ctDNA是全稱是循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA），ctDNA在cfDNA中的占比很小，僅為0.1%-5%。因此，ctDNA檢測最大的挑戰(zhàn)來自于正常血細(xì)胞來源的DNA干擾，如克隆性造血相關(guān)突變。
來自美國紀(jì)念斯隆·凱瑟琳癌癥中心（MSKCC）病理學(xué)主任Jorge Reis-Filho和臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)家PadramRazavi共同主導(dǎo)了這項研究，他們使用超深度測序（深度60,000×）驗證124名晚期癌癥（乳腺癌、肺癌、前列腺癌）患者的cfDNA突變的真正來源，并明確臨床測序方法測得ctDNA突變的真實性。此項臨床研究設(shè)計異?？b密，共使用了兩種測序方法，一種是FDA批準(zhǔn)的臨床測序方法，另一種是超深度測序。并對比使用兩種測序方法時，ctDNA與配對白細(xì)胞、ctDNA與配對組織的突變譜一致性。對照組為47名未罹患腫瘤的健康人。考慮到腫瘤治療會引起克隆性造血相關(guān)突變增加，入組的124名患者在cfDNA獲取時前后6周均未進(jìn)行任何治療。研究者還充分驗證了超深度測序的高度準(zhǔn)確性。嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的試驗設(shè)計：先明確ctDNA腫瘤突變，再利用深度測序明確ctDNA真實性#超深度測序：靶向目標(biāo)區(qū)域2M，深度60,000×，該方法具有極高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，且使用數(shù)字液體PCR進(jìn)行了充分驗證。每堿基錯誤率僅為1×10-5至3×10-5，假陽性率為每一百萬堿基測序錯誤<1次。
令人驚訝的結(jié)果一：cfDNA突變與組織突變的真實一致性不到1/4使用超深度測序后，cfDNA與配對組織的一致性僅有24.4%，而臨床測序法得到的一致性為72%。令人驚訝的結(jié)果二：超過50%的ctDNA突變其實是“假陽性”，即來源于白細(xì)胞而非腫瘤通過超深度測序發(fā)現(xiàn)，晚期癌癥患者即使通過FDA批準(zhǔn)的臨床測序方法得到的ctDNA突變結(jié)果，53.2%竟不是腫瘤突變，而是白細(xì)胞突變！導(dǎo)致ctDNA突變超過50%假陽性的原因是克隆性造血相關(guān)突變增多。腫瘤治療（如放療、化療）很容易誘導(dǎo)出現(xiàn)克隆性造血相關(guān)突變。X軸：每個cfDNA樣本 Y軸：cfDNA每兆（Mb）的突變變異因此，來自美國紀(jì)念斯隆·凱瑟琳癌癥中心的臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)家和病理學(xué)家非常擔(dān)憂：現(xiàn)行的ctDNA臨床測序方法（即使是FDA批準(zhǔn)）可能無法有效清除大量克隆性造血突變的背景干擾，因此ctDNA的基因突變譜、包括TMB在內(nèi)分子標(biāo)簽的準(zhǔn)確性就大打折扣。因為如果不同時對白細(xì)胞進(jìn)行60,000X以上超深度測序（臨床使用的cfDNA測序方法一般在10,000×），ctDNA突變檢測假陽性會≥50%，如果患者接受放化療，假陽性會更高。寫到這里，小編也不禁為眾多基于ctDNA的巨額投資項目捏把冷汗。號稱用cfDNA/ctDNA能完美解決腫瘤早篩的觀點現(xiàn)在看來還有不少的問題需要去面對。無獨有偶，英國肺癌研究聯(lián)盟（TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy [Rx]）10月也在《自然·醫(yī)學(xué)》發(fā)表了重磅的研究成果，TRACERx研究呈現(xiàn)了基于CTC的高通量測序（CTC-NGS）能夠?qū)崟r追蹤肺癌進(jìn)化軌跡，提前數(shù)月獲取轉(zhuǎn)移灶的基因信息，展現(xiàn)了精準(zhǔn)預(yù)防轉(zhuǎn)移發(fā)生的巨大臨床應(yīng)用前景。研究共納入了100位早期非小細(xì)胞肺癌患者。研究發(fā)現(xiàn)，早期肺癌患者手術(shù)時的肺靜脈CTC（PV-CTC）能有效預(yù)測手術(shù)后的生存和復(fù)發(fā)情況。更值得關(guān)注的是，研究者運用高通量測序技術(shù)對腫瘤組織（原發(fā)灶多個部位、轉(zhuǎn)移灶）和液體活檢標(biāo)本（CTC和cfDNA）進(jìn)行基因分析，并分別對比了ctDNA、CTC與原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移病灶間的信息一致性，旨在揭示腫瘤演化軌跡，探尋轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制，為臨床如何干預(yù)能有效降低肺癌復(fù)發(fā)率，預(yù)防轉(zhuǎn)移提供研究基礎(chǔ)。令人驚喜的結(jié)果一：肺癌早期的CTC比cfDNA攜帶更全面的腫瘤基因信息肺癌早期CTC和ctDNA能否攜帶全面的腫瘤實時生物學(xué)信息，直接影響其在液體活檢領(lǐng)域的發(fā)展前景。本研究充分證實了CTC在全面反映腫瘤生物學(xué)信息中的獨特優(yōu)勢。
令人驚喜的結(jié)果二：肺癌早期CTC與10個月后轉(zhuǎn)移灶基因突變一致性達(dá)到91%肺癌早期PV-CTC91%的突變可在10個月后發(fā)生的轉(zhuǎn)移灶組織中檢出（181/198），而在原發(fā)灶該比例只有79%（157/198）。令人驚喜的結(jié)果三：肺癌早期CTC與轉(zhuǎn)移灶屬于同一腫瘤進(jìn)化分支，是肺癌復(fù)發(fā)的直接原因研究者通過系統(tǒng)的腫瘤進(jìn)化生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肺癌早期CTC和轉(zhuǎn)移灶屬于同一特異的腫瘤進(jìn)化分支，該分支與原發(fā)腫瘤截然不同。因此肺癌早期的CTC正是導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)的直接原因。腫瘤早期CTC不僅能攜帶原發(fā)腫瘤的突變信息，也能攜帶數(shù)月后發(fā)生的轉(zhuǎn)移灶突變信息，這提示了CTC在克服腫瘤時空異質(zhì)性，提供腫瘤實時、全景基因突變譜的獨特優(yōu)勢，CTC甚至為提前預(yù)知轉(zhuǎn)移機制、明確遏制轉(zhuǎn)移的治療靶點、降低肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)率方面，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛能。
最后，小編腦海里不禁浮現(xiàn)出那句老話：上帝關(guān)上一道門，就會打開一扇窗。在cfDNA帶大家兜了一大圈又一圈之后，CTC不失時機地褪去“佛性”，開始出場了。至于CTC的熱度能有多猛？液體活檢的“下半場”，還讓我們拭目以待！[1] Razavi, P., Li, B.T., Brown, D.N, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nature medicine, 2019. doi:10.1038/s41591-019-0652-7[2] Chemi, F., Rothwell, D.G., McGranahan, N. et al. Pulmonary venous circulating tumor cell dissemination before tumor resection and disease relapse. Nat Med 25, 1534–1539 (2019) doi:10.1038/s41591-019-0593-1
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