急性肺損傷（acutelung injury，ALI）是由病毒、細菌、感染等因素誘發(fā)的肺組織免疫炎癥性疾病，由于免疫細胞的過度活化，炎癥反應失控，形成炎癥因子風暴，進而損傷血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞，造成肺組織通/換氣功能障礙[1]。在眾多的免疫細胞中，肺組織巨噬細胞參與了炎癥的發(fā)生、發(fā)展全過程。肺組織巨噬細胞長期存在于肺中，是肺局部炎癥微環(huán)境和炎癥反應最重要的調(diào)節(jié)細胞，主要包括肺泡巨噬細胞、肺間充質(zhì)巨噬細胞、支氣管巨噬細胞等，其中肺泡巨噬細胞所占比例大于90%，是肺內(nèi)巨噬細胞發(fā)揮生物活性的主體[2]。
研究表明，肺泡巨噬細胞極化失衡是導致炎癥反應加劇和ALI發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，巨噬細胞根據(jù)環(huán)境刺激反應的不同，可被激活為經(jīng)典激活的巨噬細胞（classically activated macrophages，M1）和替代激活的巨噬細胞（alternativelyactivated macrophages，M2），被稱為巨噬細胞的M1/M2型極化[3]。M1型巨噬細胞以吞噬殺菌、釋放炎癥因子、促炎作用為主，M2型巨噬細胞以釋放抗炎因子、抑制炎癥反應、促進組織修復功能為主。在炎癥反應過重時促進肺泡巨噬細胞M2型極化能有效地抑制炎癥反應，阻止ALI的發(fā)展[4]。
肺腸合治是中醫(yī)藥治療ALI的臨床常用治法，麻黃-大黃是體現(xiàn)肺腸合治法的主要藥對，多個以麻黃-大黃為核心藥物的方藥被臨床和實驗證實對ALI療效確切[5-7]。已有研究表明麻黃、大黃能抑制巨噬細胞M1極化，在哮喘和膿毒血癥的治療中發(fā)揮抗炎作用[8-10]。目前麻黃-大黃藥對是否能夠通過促進肺泡巨噬細胞M2極化抑制炎癥反應，從而防治ALI尚不清楚。因此，本研究采用ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制備ALI大鼠模型，考察麻黃-大黃藥對抑制炎癥反應、干預肺泡巨噬細胞M2極化的作用。
1 材料
1.1 動物
SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，8周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號SCXK（川）2020-030。動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（批準號2020DW-011-09）。
1.2 藥品與試劑
大黃免煎顆粒（批號20120030）、麻黃免煎顆粒（批號20020037）購自四川新綠色科技發(fā)展有限公司；地塞米松注射液（批號20200902，5 mg/mL）購自重慶市先鋒動物藥業(yè)有限公司；LPS（批號065M8209V）購自美國Sigma-Aldrich公司；β-actin抗體（批號AF1627）、F4/80抗體（批號30325T）購自美國CTS公司；CD206抗體（批號sc-376012）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）抗體（批號sc-365858）購自Santa crus公司；精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）抗體（批號DF6657）購自Affinity公司；熒光FITC標記的IgG抗體（批號BA1101）、熒光Cy3標記的IgG抗體（批號BA1032）購自武漢博士德生物工程有限公司；APC標記F4/80抗體（批號123116）、PE標記CD206抗體（批號141705）購自Biolegend公司。
1.3 儀器
全自動高壓滅菌器（日本三洋公司）；RM 2016型病理切片機（德國Leica公司）；JK-6型組織攤烤片機、JT-12J型脫水機（武漢俊杰公司）；HI650型離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司）；C2500-R-230V型微型高速離心機（美國Labnet公司）；DYCZ-40型電轉儀（北京六一儀器廠）；ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；cytoFLEX流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；EDC-810型qRT-PCR系統(tǒng)（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 藥物的制備
麻黃9 g、大黃12 g為成人每次給藥劑量，成人按60 kg體質(zhì)量計算，動物給藥劑量根據(jù)成人與大鼠體質(zhì)量換算，確定大鼠的等效劑量為2.2g/kg，本研究中麻黃-大黃藥對的低、中、高劑量組對應的劑量分別為2.2、4.4、8.8 g/kg。麻黃-大黃免煎顆粒溶于蒸餾水中，分別配制成質(zhì)量濃度為1.1、2.2、4.4 g/mL的混懸液。
2.2 動物分組、造模及給藥
60只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、麻黃-大黃低、中、高劑量（2.2、4.4、8.8 g/kg）組和地塞米松（5 mg/kg）組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠ipLPS（10 mg/kg）制備ALI模型[11]，造模后各給藥組立即ig 2 mL相應藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，每8小時1次，連續(xù)3次。末次給藥8 h后，大鼠ip 25%戊巴比妥麻醉處死，取肺組織備用。
2.3 麻黃-大黃對ALI大鼠肺組織病理的影響
取各組大鼠肺組織，固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，石蠟切片（3～4 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水；進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。
2.4 免疫熒光雙標檢測肺組織肺泡巨噬細胞表面標記物F4/80和M2肺泡巨噬細胞表面標記物CD206、IL-10的表達
取各組大鼠肺組織石蠟切片，脫蠟，梯度乙醇復水，加入枸櫞酸緩沖液加熱進行抗原修復；加入一抗F4/80（1∶100），于4 ℃濕盒中避光孵育15 h；加入熒光二抗染色（紅色），加入血清封閉后，加入一抗CD206（1∶100）、IL-10（1∶50），于4 ℃濕盒中避光孵育15 h，加入熒光二抗染色（綠色），復染核，封片，于顯微鏡下觀察并采集圖像。
2.5 流式細胞術檢測肺組織F4/80標記的肺泡巨噬細胞和CD206標記的M2肺泡巨噬細胞百分比
取各組大鼠肺組織，剪碎后加入0.5%膠原酶和0.25%胰酶，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，將肺組織懸液濾過、離心、清洗、重懸得到細胞，收集細胞，計數(shù)，分別加入F4/80（0.125 mg/test）和CD206（0.125 mg/test），4 ℃避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min，避光孵育50 min；加入工作液，采用流式細胞儀檢測分析。
2.6 qRT-PCR檢測肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達
取各組大鼠肺組織100 mg，加入組織裂解液制成勻漿，Trizol法提取總RNA，并測定純度和濃度。按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，進行qRT-PCR分析。反應體系為20 μL，PCR擴增程序：90 ℃循環(huán)預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸34 s，共設定40個循環(huán)。相對定量法計算各指標mRNA的2???Ct值。引物序列由北京擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。
2.7 Western blotting檢測肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達
取各組大鼠肺組織，加入裂解液勻漿，裂解30 min。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后分別加入IL-10（1∶1000）、Arg-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）特異性抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌后，加入HRP標記的二抗（1∶5000），37 ℃搖床孵育2 h，顯影并掃描膠片。采用Image-J凝膠分析軟件定量條帶強度，以?-actin作為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。
2.8 統(tǒng)計學分析
采用Graph PadPrism 7軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以 表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA）。
3 結果
3.1 麻黃-大黃對ALI大鼠肺組織病理的影響
如圖1所示，對照組大鼠肺泡組織結構完整，呈空腔狀，肺泡排列整齊，周圍間隙內(nèi)無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡塌陷，結構紊亂，肺間質(zhì)增厚、水腫，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，氣道狹窄并可見大量紅細胞；麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺泡結構部分恢復，肺間質(zhì)增厚與水腫減輕，氣道出血與炎性細胞浸潤減少；麻黃-大黃低劑量組大鼠肺組織仍然可以見炎性細胞浸潤與氣道出血，肺間質(zhì)水腫改變不明顯，但可見個別肺泡結構恢復；地塞米松組大鼠肺泡結構部分恢復，炎細胞浸潤減少，但仍可見肺間質(zhì)水腫。
3.2 免疫熒光雙標檢測肺組織肺泡巨噬細胞表面標記物F4/80和M2肺泡巨噬細胞表面標記物CD206的表達
如圖2所示，對照組大鼠肺組織偶見F4/80陽性（紅色）和CD206陽性（綠色）肺泡巨噬細胞表達；模型組大鼠肺組織F4/80陽性和CD206陽性肺泡巨噬細胞數(shù)目增多，熒光表達增強，且部分CD206陽性細胞與F4/80陽性細胞共定位表達，表明在急性肺損傷發(fā)生時，LPS誘導肺泡巨噬細胞大量活化，同時部分肺泡巨噬細胞向M2型極化，呈現(xiàn)抗炎表型；麻黃-大黃各劑量組和地塞米松組大鼠肺組織F4/80陽性肺泡巨噬細胞顯著減少，熒光強度減弱，CD206陽性巨噬細胞則明顯增多，說明麻黃-大黃能夠抑制肺泡巨噬細胞的活化，同時促進其向M2極化。
3.3 免疫熒光雙標檢測肺泡巨噬細胞表面標記物F4/80和抗炎因子IL-10的表達
如圖3所示，對照組大鼠肺組織可見F4/80陽性肺泡巨噬細胞（紅色）和IL-10（綠色）少量表達；模型組大鼠肺組織F4/80陽性肺泡巨噬細胞數(shù)目增多，熒光表達增強，同時IL-10熒光表達也明顯增強，且部分IL-10和F4/80呈共表達，IL-10是由M2型巨噬細胞釋放的抗炎因子，兩者的共表達表明在ALI發(fā)生時，部分肺泡巨噬細胞會向M2型極化，同時釋放抗炎因子以抑制炎癥反應，減輕組織損傷；麻黃-大黃高、中劑量和地塞米松組大鼠肺組織F4/80陽性肺泡巨噬細胞減少，IL-10表達進一步升高；麻黃-大黃低劑量組可見大量F4/80陽性肺泡巨噬細胞和少量的IL-10的共表達，說明麻黃-大黃高、中劑量藥物能促進M2肺泡巨噬細胞激活并釋放抗炎因子IL-10，從而抑制炎癥反應，緩解ALI。
3.4 流式細胞檢測肺組織F4/80標記的肺泡巨噬細胞和CD206標記的M2肺泡巨噬細胞百分比
如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織F4/80標記的肺泡巨噬細胞百分比和CD206標記的M2肺泡巨噬細胞百分比均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組肺組織F4/80標記的肺泡巨噬細胞百分比均顯著降低（P＜0.01），CD206標記的M2肺泡巨噬細胞百分比均顯著升高（P＜0.01），進一步證實麻黃-大黃能夠抑制肺泡巨噬細胞的激活，促進肺泡巨噬細胞M2極化。
3.5 qRT-PCR檢測肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達
如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織抗炎因子IL-10和Arg-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達水平進一步升高（P＜0.01）。
3.6 Western blotting檢測肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達
如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織抗炎因子IL-10和Arg-1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達水平進一步升高（P＜0.01）。表明麻黃-大黃能夠促進肺泡巨噬細胞釋放抗炎因子。
4 討論
目前針對ALI的治療，尚無療效確切的藥物，糖皮質(zhì)激素類藥物因其具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強應激反應等藥理作用，應用于ALI的治療，尤其在新型冠狀病毒肺炎導致的ALI中被廣泛應用[12]。研究表明，地塞米松通過抑制巨噬細胞活化，在LPS誘導的炎癥和ALI中發(fā)揮保護作用[13]。故本研究選用地塞米松為陽性對照藥物，從肺泡巨噬細胞M2極化的角度來對比其與麻黃-大黃藥對對ALI的影響。巨噬細胞是免疫系統(tǒng)應對外界刺激的第一道防線，在病原微生物的吞噬、抗原提呈等方面發(fā)揮著重要的作用，當有病原微生物入侵時，肺組織的巨噬細胞被喚醒并募集循環(huán)中的巨噬細胞向肺組織遷移，并啟動免疫反應。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)大鼠ip LPS后，肺組織F4/80標記的肺泡巨噬細胞數(shù)量顯著增多，同時病理組織學結果證實，肺組織發(fā)生了嚴重的損傷，這與文獻報道結果一致[14]。
肺泡巨噬細胞在吞噬入侵肺組織病原微生物的同時也分泌多種細胞因子，通過不同途徑啟動免疫炎癥反應，并調(diào)節(jié)著炎癥反應的進程[15]。當病原微生物入侵時，肺泡巨噬細胞向M1極化，在吞噬入侵者的同時，釋放炎癥因子，促發(fā)炎癥反應，從而激活機體免疫系統(tǒng)以盡快應對外來的刺激。然而肺泡巨噬細胞過度的M1極化則導致炎癥反應加劇，造成肺組織損傷，由此看來，肺泡巨噬細胞似乎是導致ALI的罪魁禍首。然而，肺泡巨噬細胞會根據(jù)環(huán)境的改變而轉換其極化表型，當病原微生物被逐漸清除，肺泡巨噬細胞則逐漸向M2型極化，釋放抑炎因子，抑制炎癥反應，促進受損組織修復。本研究結果表明，大鼠ip LPS后，F(xiàn)4/80標記的肺泡巨噬細胞增多的同時，CD206標記的M2型巨噬細胞的表達也部分增強，但由于M2型巨噬細胞的數(shù)量有限，仍不能有效地抑制炎癥反應，因此，促巨噬細胞的M2極化是對抗M1極化，抑制炎癥反應的有效途徑之一。
肺腸合治法是中醫(yī)臨床治療肺系疾病的經(jīng)典治法，通常采用宣肺與通腸藥物配伍，針對ALI初期肺熱腑實證療效顯著[16-17]。本課題組前期研究肺腸合治法治療ALI的作用機制時，發(fā)現(xiàn)體現(xiàn)肺腸合治的麻黃湯和大承氣湯聯(lián)合應用具有顯著的抑制炎癥反應、改善肺水腫的作用[18-19]。麻黃、大黃分別是麻黃湯和大承氣湯中的君藥，2藥根據(jù)《方劑學》麻黃湯和大承氣湯中用量分別為9、12 g[20]，故本研究選用麻黃-大黃藥對依照前期藥物劑量比3∶4來探索其對ALI大鼠的治療作用。結果發(fā)現(xiàn)麻黃-大黃藥對及地塞米松均可明顯改善ALI大鼠的肺組織損傷，抑制炎癥細胞浸潤，減少肺泡巨噬細胞活化，改善間質(zhì)水腫和肺組織結構紊亂等病理狀態(tài)。免疫組化和流式細胞術檢測結果均證實麻黃-大黃藥對能抑制肺泡巨噬細胞的活化并促進其向M2型極化。
IL-10和Arg-1同屬于M2型巨噬細胞釋放的細胞因子，因此也被用來作為M2巨噬細胞的標記物[21]。IL-10是一種多效性細胞因子，可以在多種類型細胞中發(fā)揮免疫抑制或免疫刺激的作用。在炎癥反應方面，IL-10能通過下調(diào)單核細胞表面主要組織相容性抗原II的表達，降低其抗原呈遞作用，下調(diào)T淋巴細胞活性，抑制炎性細胞的激活、遷移和黏附；同時IL-10也能抑制炎癥因子的合成與釋放，內(nèi)源性與外源性IL-10均能在轉錄水平強烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、粒-巨噬細胞集落刺激因子和粒細胞集落刺激因子的合成，從而起到抗炎的作用[22]。Arg-1可促使精氨酸降解為脯氨酸，而脯氨酸是膠原蛋白合成的基礎物質(zhì)，在促進損傷肺組織修復方面發(fā)揮了重要的作用[23]。免疫熒光雙標結果證實，麻黃-大黃藥對在促進肺泡巨噬細胞M2極化的同時，還能促進IL-10的表達，且IL-10與CD206呈共表達，這一結果證實IL-10的增多與AM的M2極化相關，隨后的qRT-PCR和Western blotting檢測結果證實，麻黃-大黃藥對能提高肺組織IL-10和Arg-1 mRNA和蛋白表達水平。
本研究結果顯示，麻黃-大黃藥對可改善ALI大鼠肺組織炎癥損傷，減少肺泡巨噬細胞的活化，同時促進肺泡巨噬細胞向M2抗炎表型極化，促進抗炎因子IL-10和組織修復因子Arg-1的激活與釋放。本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松雖然能部分改善ALI大鼠肺組織病理變化，但對肺泡巨噬細胞M2極化沒有明顯的影響，實驗研究證實將含有地塞米松的脂質(zhì)體遞送到炎癥部位的巨噬細胞中，會抑制纖維化肺組織中肺泡巨噬細胞的M2極化，降低肺組織中IL-10和Arg-1水平[24]。在急性炎癥發(fā)生時，為了應對炎癥反應的加劇，在巨噬細胞M1極化增強的同時，M2極化也會適應性的增強，以應對炎癥反應[25]。因此地塞米松在抑制巨噬細胞M1極化，減輕炎癥反應的同時也抑制了肺泡巨噬細胞M2極化。本研究僅觀察了麻黃-大黃對肺泡巨噬細胞M2極化的影響，其促進肺泡巨噬細胞的M2極化機制還需要進一步研究。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：王旭紅，閆曙光，惠 毅，史 捷，李京濤．基于肺泡巨噬細胞M2極化的麻黃-大黃藥對治療急性肺損傷的作用機制研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(9): 2715-2722.
