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意義

Tirzepatide 是葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體 (GIPR) 和胰高血糖素樣肽-1 受體 (GLP-1R) 的雙重激動劑，它們是調(diào)節(jié)碳水化合物代謝的腸促胰島素受體。在 2 型糖尿病受試者的臨床試驗中，該研究藥物已證明優(yōu)于選擇性 GLP-1R 激動劑。有趣的是，雖然 tirzepatide 在激活 GIPR 方面與天然 GIP 非常相似，但它在激活 GLP-1R 方面與 GLP-1 顯著不同，從而導致激動劑誘導的受體脫敏作用較少。我們報告了低溫電子顯微鏡和分子動力學模擬如何為 tirzepatide 的獨特藥理學提供結構基礎。這些研究揭示了脂肪酸修飾與氨基酸序列相結合的程度，

抽象的

Tirzepatide (LY3298176) 是一種脂肪酸修飾的雙腸促胰島素受體激動劑，在葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體 (GIPR) 上表現(xiàn)出與天然 GIP 相似的藥理學，但在胰高血糖素樣肽 1 上表現(xiàn)出偏向于環(huán)磷酸腺苷信號傳導受體（GLP-1R）。除了 GIPR 信號，GLP-1R 的通路偏差可能有助于 tirzepatide 在改善 2 型糖尿病中的葡萄糖控制和體重調(diào)節(jié)方面的功效。為了研究 tirzepatide 差異信號的結構基礎，將機械藥理學研究與低溫電子顯微鏡結合起來。在這里，我們報告了與 GIPR 和 GLP-1R 復合的 tirzepatide 的高分辨率結構。與天然配體類似，tirzepatide 采用 α-螺旋構象，N 末端到達兩個受體的跨膜核心深處。N末端酪氨酸（Tyr1）的分析^tirzepatide的 Tzp) 顯示與 GLP-1R 的相互作用較弱。分子動力學模擬表明，與 GLP-1R 相比，tirzepatide 的脂質(zhì)部分和 GIPR 之間更傾向于間歇性氫鍵，這與更緊湊的 tirzepatide-GIPR 復合物一致。根據(jù)這些分析，tirzepatide 被解構，揭示了一種受?；蕾囆孕盘栟D(zhuǎn)導影響的肽結構-活性關系。對于 GIPR，Tyr1 ^Tzp和其他在受體核心內(nèi)產(chǎn)生強烈相互作用的殘基允許 tirzepatide 耐受脂肪酸修飾，產(chǎn)生與 GIP 相等的親和力。相反，與 GLP-1R 的細胞外結構域的高親和力結合，再加上 Tyr1 ^{Tzp的穩(wěn)定性降低}和脂質(zhì)部分，促進偏向信號和減少受體脫敏。總之，這些研究為 tirzepatide 功能的結構決定因素提供了信息。

設計能夠靶向多個受體系統(tǒng)的治療性配體為發(fā)現(xiàn)更有效的復雜疾病治療提供了機會，特別是對于干預多個信號通路可能有益的情況。一個這樣的分子是 tirzepatide (LY3298176)，一種 39 個氨基酸的線性肽，對葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體 (GIPR) 和胰高血糖素樣肽-1 受體 (GLP-1R) 具有激動劑活性 ( 1 , 2）。該分子的雙重激動劑性質(zhì)代表了一種有前途的治療方式，用于治療代謝紊亂，例如 2 型糖尿病 (T2DM)、肥胖癥（包括射血分數(shù)保留的心力衰竭患者）和非酒精性脂肪性肝炎。這種治療方法是建立在選擇性 GLP-1R 激動劑的既定臨床療效的基礎上，雙功能概念是由兩種受體的協(xié)同激活改善葡萄糖控制、能量平衡和脂質(zhì)儲存的假設所告知的 ( 3 , 4）。除了雙重藥理學之外，保持藥物的有效濃度對于最大限度地提高此類治療的益處很重要。因此，為了維持 tirzepatide 的作用，肽通過位于分子中間附近的賴氨酸通過親水性接頭與 C20 脂肪二酸部分結合 ( 2 )。這種脂肪酸修飾能夠?qū)崿F(xiàn)與人血清白蛋白的可逆、非共價結合，因此有助于形成每周一次給藥的藥代動力學特征 ( 1 )。

迄今為止，替西帕肽的臨床開發(fā)項目取得了令人鼓舞的結果，數(shù)據(jù)顯示血糖控制和能量代謝有所改善。在一項 26 周的 2b 期試驗中確定了替西帕肽有效降低 T2DM 受試者的血糖和體重的功效 ( 5 )。此外，該試驗的事后分析報告稱，tirzepatide 治療對胰島素敏感性和胰腺 β 細胞功能的標志物具有良好的效果，并且還減少了致動脈粥樣硬化的脂質(zhì)顆粒 ( 6 , 7 )。有趣的是，胰島素敏感性的改善在很大程度上與體重的變化無關（6）。這些數(shù)據(jù)支持啟動 tirzepatide 的 3 期臨床開發(fā)計劃，稱為 SURPASS ( 8 )，特別是 SURPASS-2（一項針對 T2DM 受試者的 40 周關鍵試驗）報告的結果表明雙重治療的益處GIP/GLP-1 藥理學 ( 9 )。在這項針對目前批準的最高劑量 GLP-1R 單激動劑 semaglutide 的頭對頭研究中，所有三種劑量的 tirzepatide 均能顯著降低血糖和減輕體重。替西帕肽優(yōu)越的臨床療效表明在 GLP-1 治療中加入 GIP 藥理學的優(yōu)勢。

由于臨床數(shù)據(jù)，確定用替西帕肽治療后代謝控制改善的機制是一個積極研究的領域。使用從Gipr或Glp-1r敲除小鼠中分離的胰島進行的離體試驗和在這兩種模型中進行的葡萄糖耐量試驗表明，替西帕肽可以通過任一受體增強胰島素分泌并降低高血糖癥 ( 1）。藥理學上，受體特異性環(huán)磷酸腺苷 (cAMP) 積累測定表明，替西帕肽是一種不平衡的激動劑，有利于 GIPR 而不是 GLP-1R 活性；這些結果與結合數(shù)據(jù)一致，表明 tirzepatide 對 GIPR 的親和力與 GIP 的親和力相等，但在 GLP-1R 上比 GLP-1 弱約五倍 ( 1 , 10 )。研究結果支持強 GIPR 活性的益處表明 GIPR 激動通過獨立于體重減輕的機制提高胰島素敏感性 ( 11 )。此外，大腦中完整的 GIP 軸對于實現(xiàn)雙重 GIPR 和 GLP-1R 激動劑治療的完全厭食作用是必要的（12）。與這兩個發(fā)現(xiàn)一致，GIPR 在脂肪組織和大腦中某些代謝控制中心的表達可能有助于 tirzepatide 的 GIP 成分的益處 ( 3 )。

同時，對 tirzepatide 在 GLP-1R 的藥理學特征的研究表明，它顯示出 cAMP 信號通路偏向于 β-arrestin 募集 ( 10 , 13 )。這一發(fā)現(xiàn)的重要性尚未完全實現(xiàn)，但可能是實質(zhì)性的，因為有報道顯示 GLP-1R 激動劑艾塞那肽的偏向類似物在嚙齒動物模型中比非偏向母體分子更有效 ( 14 , 15 )）。總之，普遍的證據(jù)支持將有效的 GIPR 激動劑與偏向的 GLP-1R 信號相結合的治療益處，與替西帕肽臨床研究的有希望的結果一致。因此，本文進行和介紹的實驗旨在更好地了解 tirzepatide 在分子水平上對 GIPR 和 GLP-1R 的獨特配體結合和藥理學特征。

結果和討論

Tirzepatide 與 GIPR 和 GLP-1R 復合的低溫電子顯微鏡 (Cryo-EM) 結構。

為了研究 tirzepatide 藥理特性的分子基礎，GIPR 與天然 GIP 復合物的高分辨率結構（3.2-? 分辨率）以及與 tirzepatide 結合的 GIPR 和 GLP-1R（3.1-? 和 2.9-? 分辨率），分別）由冷凍電鏡確定（圖 1 A和SI 附錄，圖 S1 和 S2 以及表 S1）。配體被可靠地建模為密度圖（SI 附錄，圖 S1 和 S2），GIP 和替西帕肽的殘基 1 至 32 在結構中被解析，與在先前報道的結構中解析的 GLP-1 的長度相當GLP-1R ( 16 , 17）。重要的是，GIP/GIPR 結構確立了該受體的激活機制，并且與 GLP-1 和胰高血糖素與各自受體的復合物相似，GIP 采用連續(xù)螺旋構象 ( 16 , 18 )。N 末端插入跨膜 (TM) 結構域，通過廣泛的極性和疏水相互作用與 TM1、TM2、TM3、TM5、TM7 和細胞外環(huán) 2 (ECL2) 中的殘基接觸（圖 1 A和B）。值得注意的是，位置 1 的酪氨酸 (Tyr1 ^{GIP ) 被埋在 GIPR 的 TM 核心中，與 Gln224}^3.37形成氫鍵并與 Trp296 ^5.36進行芳香相互作用（圖 1 B）。Tyr1 在 GIP 結合和受體激活中的關鍵作用得到了對 GIP 的截短或突變類似物的研究的支持 ( 19 , 20 )。最近已經(jīng)描述了關于 GIP/GIPR 相互作用的決定因素的類似結果和結論 ( 21 )。與其與 GIP N 末端部分的序列相似性一致，tirzepatide 以類似的方式結合 GIPR（圖 1 A和C）。tirzepatide 的 N 末端片段（~殘基 1 至 14）的主鏈與 GIP 的等效片段大部分重疊（圖 1 D和E）。盡管 tirzepatide 和 GIP 的大多數(shù)相互作用是相似的，但關鍵的區(qū)別是 tirzepatide 的第 7 位 (Thr7 ^Tzp ) 處的蘇氨酸（相對于 GIP 中的異亮氨酸），它提供與 Arg190 ^2.67GIPR的氫鍵（圖1D），模擬兩者之間的相互作用等效的 Thr13 ^GLP-1和 Lys197 ^2.67GLP-1R ( 17 )。此外，Arg190 ^2.67GIPR的側(cè)鏈與 GIP 結合結構的構象略有不同，使其更接近 Tyr1 ^Tzp。^{Tyr1 Tzp}的側(cè)鏈采用不同的旋轉(zhuǎn)異構體，羥基指向Arg190 ^2.67GIPR和 Gln220 ^3.33GIPR（圖 1 D），冷凍電鏡圖表明這些殘基之間存在水介導的極性相互作用（SI 附錄，圖 S3）。額外的相互作用表明 tirzepatide 的序列可以在 GIPR 促進更高的親和力和效力特性。圖 2。

圖。1。

GIPR/GIP、GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 的冷凍電鏡結構測定。（一）GIPR（橙色）/GIP（黃色）的整體結構（3.2-?分辨率）GIPR（洋紅色）/tirzepatide（藍色）（3.1-?分辨率）和GLP-1R（石板藍）/tirzepatide（綠色））（2.9-? 分辨率）。復合物的其他亞基著色如下：GsαiN18，鮭魚；Gβ，深綠色；Gγ，灰色；Nb35，棕色；ScFv16，紫褐色。( B , C ) GIP ( B ) 或替西帕肽 ( C ) 與 GIPR 的 TM 結構域的相互作用。參與相互作用的殘基顯示為棒，并標記了貢獻最顯著相互作用的殘基。氫鍵被標記為破折號。( D) GIP 和替西帕肽第 7 位殘基的差異。( E ) GIP 和 tirzepatide 與 GIPR 的 ECD 和 ECL1 的相互作用。

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圖 2。

tirzepatide (TZP) 與 GLP-1 在 GLP-1R 的差異結合。（一）與 GLP-1R 結合的 TZP 的總體方向（GLP-1R 板巖藍色；Tzp，綠色）與 GLP-1R（青色）/GLP-1（灰色）（PDB：6×18）相比，GIPR（橙色）/GIP（黃色）和 GIPR（洋紅色）/Tzp（藍色）。（乙）TZP 的位置遠離 GLP-1R 的 ECL2，而 Arg299 ^ECL2不與 TZP 相互作用。參與顯著相互作用的殘基顯示為棒。氫鍵標記為破折號。（C）Tyr1 ^Tzp的體積導致 Trp306 ^5.36的旋轉(zhuǎn)異構體不同，破壞 GLP-1R 的 TM5 和 ECL3 之間的相互作用。

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GIP 的 C 末端（~殘基 15 至 32）與細胞外結構域 (ECD) 和 ECL1 相互作用，總體而言，類似于與 GLP-1R 結合的 GLP-1 的相互作用模式 ( 16 )。ECD 以與先前對 GIPR 的孤立 ECD 的晶體學研究相同的方式參與 GIP ( 22 )，我們的研究通過顯示 GIPR 的 ECL1 也有助于與 C 末端區(qū)域的相互作用提供了全面的理解的 GIP，最值得注意的是 His18 ^GIP和 Trp25 ^GIP（圖 1 E）。與 GLP-1R ( 16 ) 和胰高血糖素受體 (GCGR) ( 23 )相比，ECL1 在 GIPR 中采用更擴展的構象)，其中形成 α 螺旋結構。ECL1中Pro195 ^GIPR、Pro197 ^GIPR、Pro199 ^GIPR的存在阻止了穩(wěn)定二級結構的形成（圖1E）。對于 tirzepatide，觀察到類似于 GIP 結合結構中的 ECL1 構象（圖 1 E），但與等效的 Cα 相比，tirzepatide 的 C 末端片段在 Trp25 的 Cα 處從 ECL1 傾斜約 3 ? GIP (圖 1 E )。此外，GIP的His18 GIP和GIPR的Tyr36 ECD形成氫鍵，替^西帕肽^不存在氫鍵，因為它含有Ala18 ^Tzp（圖 1 E）。有趣的是，與 GIP 相比，ECD-TM1 接頭在 GIPR/tirzepatide 結構中的解析更好，這表明靈活性較低（SI 附錄，圖 S4）。另外值得注意的是，Lys20 Tzp 的^側(cè)鏈在 ECD-TM1 接頭末端向 Leu128 ^1.30GIPR延伸（ SI 附錄，圖 S4）。^{正如預期的那樣，與 Lys20 Tzp}相連的脂肪酸部分在密度圖中沒有分辨出來。

總體而言，與 GLP-1 與 GLP-1R 結合的位置相比，GIP 和 tirzepatide 的螺旋在 GIPR 中的位置更遠離 ECL2，更靠近 TM1，但 TM 的大多數(shù)其他成分對于 GIPR 和 GLP-1R對齊良好（SI附錄，圖S5）。在該位置，在 Tyr10 ^GIP或 Tyr10 ^Tzp與 Gln138 ^1.40GIPR之間形成氫鍵（圖 1 B和C）。相比之下，等效的 Val16 ^GLP-1不與 Tyr145 ^1.40GLP-1R相互作用( 17 )。

盡管 GIPR/tirzepatide 結構在很大程度上類似于 GIPR/GIP 結構，但 GLP-1R/tirzepatide 結構表明 tirzepatide 以獨特的方式與 GLP-1R 結合（圖 2）。通過 TM 對齊結構顯示配體的 N 末端占據(jù)相同的空間，但與 GLP-1R 復合的 tirzepatide 的 C 末端片段向其 ECL1 傾斜（圖 2 A和SI 附錄，圖 S6 A ), 它采用與 GLP-1R/Ex-P5 結構 ( 24 ) ( SI 附錄, 圖 S6 B ) 和 GLP-1R/taspoglutide 復合物 ( 25 )中發(fā)現(xiàn)的構象相似的構象）。GLP-1R-ECL1 構象的靈活性適應具有不同序列的配體，在所有這些中，Trp214 ^ECL1與肽的 Phe-XX-Trp 基序的芳香殘基進行重要的 pi-pi 相互作用（SI 附錄，圖 S6 C )。

圖 3。

與 TZP 復合的 GIPR 和 GLP-1R 的 MD 模擬。( A ) 脂質(zhì)修飾的化學結構及其與 TZP 的 Lys20 ^Tzp的連接。( B ) 在 MD 模擬過程中，脂質(zhì)鏈與 TZP 的肽序列（左圖）或受體（右圖）觀察到的氫鍵相互作用的頻率。GIPR 的結果用藍色條表示，GLP-1R 數(shù)據(jù)用紅色表示。“X”表示受體復合物中相應殘基不存在氫鍵相互作用。（C）脂質(zhì)鏈在兩個 500 納秒 MD 上的回轉(zhuǎn)分布半徑分別在 GIPR（藍色）和 GLP-1R（紅色）復合物中運行。( D) GIPR（左）和 GLP-1R（右）中 TZP 的 MD 快照疊加。顯示來自每個復雜系統(tǒng)的 100 納秒間隔的 10 個快照。TZP 的肽部分顯示為橙色帶，脂質(zhì)鏈顯示為黃色條。

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盡管 tirzepatide 和 GLP-1 的總體方向有一些普遍的相似性，但對 GLP-1R/tirzepatide 和 GLP-1R/GLP-1 結構的詳細分析揭示了它們的結合差異，這與 tirzepatide 的較弱親和力一致 ( 10 , 16）。tirzepatide 的殘基 2 到 9 的 Cα 原子與 GLP-1 的等效氨基酸（殘基 8 到 15）很好地對齊，彼此之間的距離都在 1 ? 以內(nèi)。從 Tyr10 ^{Tzp開始，它們的等效 Cα 原子之間的距離在隨后的 2-氨基異丁酸 (Aib)13}^Tzp和 Tyr19 ^GLP-1處的螺旋轉(zhuǎn)角內(nèi)增加到約 2.2 ? （圖 2 B）。雖然這是一個適度的差異，但 tirzepatide 位置的變化導致與 GLP-1R 的 ECL2 的相互作用較弱，這與確定 GLP-1R 的信號分布有關 ( 26 , 27 )。具體來說，介導與各種 GLP-1R 配體的極性相互作用 ( 17 ) 的 Arg299 ^ECL2不會與 tirzepatide 形成這種接觸（圖 2 B和SI 附錄，圖 S7 A）。Arg299 ^ECL2突變?yōu)楸彼釙档?GLP-1 激活 cAMP 信號傳導的功效 ( 26 , 27）。另一方面，tirzepatide 位置的相對移動允許 Tyr10 ^Tzp和 Tyr145 ^1.40GLP-1R之間的 pi-pi 堆疊，通過其等效的 Tyr10 殘基 ( 28 ) 模擬胃泌酸調(diào)節(jié)素的相互作用模式（圖2B）。

tirzepatide 的 N 末端呈現(xiàn)出另一個關鍵特征，這可能導致其與 GLP-1R 結合的親和力較弱。由于 Tyr1 ^Tzp (相對于 His7 ^GLP-1 ) 的側(cè)鏈較大，Trp306 ^5.36GLP-1R采用交替的旋轉(zhuǎn)異構體，這會導致與 GLP-1R/GLP-1 結構的構象相關的空間沖突（圖2C和SI 附錄，圖 S7 B )。這種變化破壞了在 GLP-1R/GLP-1 結構中觀察到的Trp306 ^5.36和 Asp372 ECL3^之間的氫鍵（圖2C），類似于 GIPR/GIP 和 GIPR/tirzepatide 結構中的情況（SI 附錄，圖S7 C）。^{Trp306 5.36GLP-1R}的這種特定構象也改變了許多周圍殘基的構象，包括 GLP-1R-ECL2 和 Arg310 ^5.40GLP-1R的殘基。此外， GLP-1R/GLP-1 結構中Arg310 ^5.40和 Glu373 ^ECL3之間的極性相互作用也在tirzepatide結合結構中丟失（圖2C ）。由于 1 位存在酪氨酸與組氨酸，GLP-1R 的 TM5 和 ECL3 之間的極性相互作用消失了。之前的一份報告表明，ECL3 的穩(wěn)定是 GLP-1R 完全、無偏的激動所必需的（29）。與穩(wěn)定相互作用的喪失一致，GLP-1R/tirzepatide 結構中的 ECL3 在冷凍電鏡圖中顯示出較弱的密度。值得注意的是，雖然完全埋在口袋中，但 Tyr1 ^Tzp和 Trp306 ^5.36GLP-1R的密度弱于其結合口袋的其他 tirzepatide 殘基（SI 附錄，圖 S7 D），反映了它們在這種不太穩(wěn)定的構象中的靈活性。

Tirzepatide 的接頭-脂肪酸部分的動力學。

tirzepatide 的一個關鍵結構特征是 C20 脂肪二酸通過一個 L-γ-谷氨酸和兩個 8-氨基-3,6-二氧辛酸 ( 2 )的接頭連接到 Lys20 ^Tzp的側(cè)鏈氮上（圖 3 一個）。在 tirzepatide 復合的 GLP-1R 和 GIPR cryo-EM 結構中，接頭 - 脂肪酸部分和肽 C 末端（氨基酸 33 至 39，以下稱為 Ct）均出現(xiàn)無序且未解析。盡管先前沒有通過晶體學解決?；呐c GLP-1R 相互作用的結構方面 ( 30 )，但最近與 GLP-1R 結合的司美魯肽（在位置 20 處含有 C18 二酸）的低溫-EM 結構顯示了一些密度對于脂質(zhì)修飾（25 )。在這份關于 semaglutide 的報告中，對接頭脂肪酸鏈的兩種構象進行了建模，即一種與 ECD 相互作用，一種與膜相互作用 ( 25 )。

圖 4。

TZP 的 C20 二酸脂肪酸部分影響腸促胰島素受體結合親和力。使用 TZP 進行了研究受體結合和信號轉(zhuǎn)導的機制藥理學研究，TZP 是其缺乏脂質(zhì)部分的類似物 (TZP ^ΔC20 )，以及在位置 1 也含有組氨酸代替酪氨酸的衍生物 (TZP ^ΔC20,Y1H )。( A ) 對于每個配體，[ ¹²⁵ I]-GIP ( 1 – 42) 使用從表達人 GIPR 的 HEK293 細胞中分離的膜測定結合。TZP 的結合被證明等同于天然 GIP 的結合。C20 二酸脂肪酸鏈的去除增加了配體的親和力，而將酪氨酸變?yōu)榻M氨酸削弱了與受體的結合。( B )使用 GIPR 表達膜進行Gα _{s 的}配體誘導的 GTPγS 結合。與 TZP 和 GIP 相比，從 TZP 中去除脂質(zhì)部分導致 Gα _{s活化的效力適度增加，但相比之下，TZP}^ΔC20,Y1H類似物的效力和效力均降低。( C) 在表達人 GIPR 的 HEK293 細胞中測量激動劑刺激的 cAMP 產(chǎn)生。與結合親和力和激活 Gα _s效力的增加一致，脂質(zhì)部分的缺失導致刺激 GIPR 介導的 cAMP 積累的效力增加，而在位置 1 的酪氨酸置換后觀察到較弱的活性。（D）對于GLP-1R，[ ¹²⁵ I]-GLP-1(7-36)NH ₂結合的競爭性抑制使用分離自表達人GLP-1R的HEK293細胞的膜測定。TZP 和 TZP ^ΔC20的結合比 GLP-1 弱約五倍，但在位置 1 將酪氨酸變?yōu)榻M氨酸恢復了與天然肽的結合親和力。(E）配體誘導的GTPγS結合Gαs_是使用表達GLP-1R的膜進行的。與 GLP-1 相比，TZP 被證明是刺激 Gα _s的部分激動劑。從 TZP 中去除脂質(zhì)部分導致有效反應增加，觀察到 TZP ^ΔC20,Y1H類似物的進一步升高。( F) 在表達 GLP-1R 的人 HEK293 細胞中測量激動劑刺激的 cAMP 產(chǎn)生。TZP 在刺激 cAMP 積累方面的效力比 GLP-1 弱 20 倍。脂質(zhì)部分的缺失提高了效力，并且含有組氨酸的非脂質(zhì)化母體肽顯示出與 GLP-1 無法區(qū)分的活性。使用含有酪氨酸代替7位組氨酸的胰高血糖素樣肽-1衍生物(GLP-1 ^H7Y )作為對照。提供的數(shù)據(jù)代表n ≥ 3 個獨立實驗。匯總數(shù)據(jù)見SI 附錄表 2。日志 M; 記錄摩爾。

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為了研究tirzepatide 的脂質(zhì)修飾在肽-受體復合物中的分布，我們在C20 二酸共軛物、Ct 和其他未解析的原子中建模。然后對與異源三聚體 G 蛋白膜中的 GIPR 或 GLP-1R 復合的 tirzepatide 模型進行一系列 1-μsec 分子動力學 (MD) 顯式溶劑模擬。結果表明，接頭-脂肪酸鏈以多種構象存在（圖3）。此外，在 MD 分析中，脂質(zhì)部分與任一受體的特異性和持續(xù)相互作用的數(shù)量相對較少（圖 3 B的右圖））。MD 還表明脂質(zhì)鏈和谷氨酰胺在 tirzepatide 的第 24 位之間的分子內(nèi)氫鍵在 GIPR 中更普遍（大約 40% 的模擬時間）比在 GLP-1R 復合物中（大約 18% 的模擬時間，圖 3 B的左面板）。總體而言，脂質(zhì)部分與受體的間歇性氫鍵在 GIPR 中比在 GLP-1R 中更分布和普遍（圖 3B的右圖）。與這些觀察結果一致，發(fā)現(xiàn) GIPR/tirzepatide 復合物中的二酸鏈比結合的 GLP-1R 復合物更緊湊，如其平均回轉(zhuǎn)半徑所示（GIPR 為 6.8 ?，GLP-為 7.6 ?） 1R) (圖 3 C），同時保持脂質(zhì)部分的溶劑可及表面積和極性表面積的相似分布（SI附錄，圖S8）。MD 快照（圖 3 D）證明了兩種受體中 tirzepatide 的構象多樣性。

替西帕肽功能的藥理學基礎。

通過對與兩種受體復合的 tirzepatide 的低溫 EM 結構的分析以及在進行 MD 模擬時提出的假設，合成了一系列肽類似物以研究 tirzepatide 藥理活性的分子基礎。這是一種基于知識的設計方法，它解構了 tirzepatide 以評估其受體結合和信號傳導特性。我們注意到，考慮到白蛋白和血清在生物測定中作為非特異性阻斷劑的常見用途，脂肪酸修飾肽的白蛋白結合傾向可能會混淆分子的藥理學比較。因此，為了避免這種情況，使用補充牛酪蛋白或桿菌肽的完全無白蛋白測定來防止非特異性結合 ( 10 )。

競爭結合測定表明，脂質(zhì)側(cè)鏈（TZP ^ΔC20）的去除產(chǎn)生的配體在 GIPR 處的親和力比替西帕肽高約四倍（圖 4A ）。替西帕肽的脂肪酸修飾特征對于該分子的持續(xù)藥代動力學是必要的（1）。結合測定結果表明，較高親和力的親本肽是 tirzepatide 整體親和力的重要貢獻者，因為它允許添加最終導致 tirzepatide 與 GIP 具有相同親和力的脂肪酸部分，這是其不平衡所需的特征效力藥理學。類似于對親和力的影響，脂質(zhì)的去除提高了配體對刺激 GIPR 介導的 Gs 活化（圖 4 B）和受體誘導的細胞內(nèi) cAMP 積累（圖 4 C ）的效力。）。與具有與 GIP 相似的 GIPR 活性的雙重 GIP/GLP-1 受體激動劑的治療目的一致，tirzepatide 的氨基酸序列包含在 GIP 中發(fā)現(xiàn)的許多相同殘基，尤其是位于 N -與 GIPR 結合口袋進行關鍵相互作用的配體的末端一半（圖 1）。特別是，冷凍電鏡結構的檢查揭示了 GIP 和 tirzepatide 的 N 端酪氨酸在受體核心底部附近相互作用中的潛在重要性（圖 1）。與該模型一致，將酪氨酸變?yōu)榻M氨酸（TZP ^ΔC20，Y1H）以匹配 GLP-1 的第一個位置，將結合親和力減弱了 20 倍（圖 4 A）。類似地，這種替代也降低了 Gs 激活和 cAMP 積累的功效（圖 4 B和C）。這些結果表明了在這個位置的天然酪氨酸對于維持 GIPR 親和力和完全激動的重要性。

圖 5。

GLP-1R 處 TZP 的偏向藥理學是通過 N 末端酪氨酸和 C20 二酸脂肪酸部分對信號傳導功效的復合效應而發(fā)生的。使用 TZP 進行了研究受體結合和信號轉(zhuǎn)導的機制藥理學研究，TZP 是其缺乏脂質(zhì)部分的類似物 (TZP ^ΔC20 )，以及在位置 1 也含有組氨酸代替酪氨酸的衍生物 (TZP ^ΔC20,Y1H )。使用 GRK2 ( A ) 和 β-arrestin ( B）招聘。在這兩個系統(tǒng)中，與 GLP-1 相比，TZP 被證明是一種較弱的部分激動劑。C20二酸脂肪酸部分的去除改善了反應，并且脂質(zhì)部分的缺失與用組氨酸代替酪氨酸的組合導致幾乎完全有效的活性。( C ) 使用 HEK293 細胞中 SNAP 標記受體的細胞表面呈現(xiàn)變化評估配體誘導的 GLP-1R 內(nèi)化。相對于 GLP-1，TZP 被證明是誘導 GLP-1R 內(nèi)化的弱的部分激動劑。與恢復 β-arrestin 募集一致，TZP ^ΔC20和 TZP ^ΔC20,Y1H衍生物顯示成比例地改善配體誘導的受體內(nèi)化。使用含有酪氨酸代替7位組氨酸的胰高血糖素樣肽-1衍生物(GLP-1 ^H7Y )作為對照。提供的數(shù)據(jù)代表n ≥ 3 個獨立實驗。匯總數(shù)據(jù)見SI 附錄表 2。（D-L ）用熒光標記的 GLP-1、TZP、TZP ^ΔC20、Y1H或 GIP標記的胰島的代表性共聚焦圖像。野生型 ( D , G , J ) 或Glp-1r null (F、I、L ) 用 30 nM GLP-1 ^AF647、TZP ^AF647、TZP ^{ΔC20、Y1H-AF647}或 (D-Ala2)GIP ^AF488處理 30 分鐘的小鼠。（E、H、K ）在用熒光標記的配體處理之前，將來自野生型小鼠的另一組胰島與 2 μM GLP-1R 拮抗劑 exendin-4 _{(9-39)預孵育。}用 Hoechst 33342 將細胞核染成藍色。 log M; 記錄摩爾。（比例尺，10 μm。）

在查看器中打開

與模仿 GIP 作用的替西帕肽相比，它在 GLP-1R 的藥理學不同于 GLP-1。先前的研究表明，tirzepatide 與 GLP-1R 結合的親和力比 GLP-1 弱 5 倍，表現(xiàn)為刺激 Gs 活化的效力較弱和效力降低，cAMP 信號傳導效力降低，配體誘導的 β-逮捕招募 ( 10）。從治療的角度來看，對 cAMP 信號傳導與 β-arrestin 募集的偏向可能有利于 tirzepatide 的 GLP-1 成分，因為它促進較少的激動劑誘導的脫敏。本報告中的研究結果進一步強調(diào)了替西帕肽在 GLP-1R 與 GIPR 的藥理學差異。例如，與去除脂質(zhì)后對GIPR的親和力增加相反，替西帕肽結合GLP-1R的親和力不受側(cè)鏈損失的影響（圖4D）。然而，非?；愃莆镌?GLP-1R 刺激的 Gs 激活中表現(xiàn)出更高的功效（圖 4 E）和在 cAMP 積累中更強的效力（圖 4 F）。此外，在非酰化類似物中將 N 末端酪氨酸變?yōu)榻M氨酸進一步提高了效力，從而在這些測定中產(chǎn)生了與 GLP-1 功能接近的配體（圖 4 E和F）。盡管非同源酪氨酸的影響與?；揎椀拇嬖谙嘟Y合，降低了 GLP-1R 刺激的 Gs 信號傳導的功效，但這種藥理學特征仍然足以通過 GLP-1R 充分增強胰島素分泌并減少高血糖，如前所述通過胰島培養(yǎng)中的 tirzepatide 和Gipr缺失小鼠的葡萄糖耐量試驗 ( 1 )。

對于 BG 類蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)，包括 GIPR 和 GLP-1R，N 端 ECD 是一種獨特的結構特征，與配體識別機制有關。有趣的是，在處理 GLP-1R/tirzepatide 冷凍電鏡數(shù)據(jù)的過程中，三維 (3D) 分類揭示了一類獨特的 GLP-1R/G 蛋白復合物，該復合物對 tirzepatide、完全無序的 ECD 和TM 結構域的敞開的細胞外袋（SI 附錄，圖 S2 和 S9）。鑒于 tirzepatide 對結合全長 GLP-1R 具有納摩爾親和力（圖 4 D)，并且在樣品制備過程中加入了飽和量的 tirzepatide，apo 復合物的存在表明 tirzepatide 與 GLP-1R TM 束的結合不如 ECD 穩(wěn)定，這與為類提出的兩步模型一致B GPCR ( 31 )。因此，為了直接評估 ECD 結合對配體親和力的貢獻，我們純化了兩種受體的 ECD，并使用表面等離子共振測量了肽配體的直接結合。發(fā)現(xiàn)配體以低微摩爾范圍內(nèi)的親和力結合 GIPR 的 ECD，特別是 tirzepatide（平衡常數(shù) [K _D ] = 4.2 μM）和 tirzepatide ^ΔC20（K _D = 1.7 μM），表明 tirzepatide 增強的受體親和力^ΔC20主要獨立于 GIPR 的 ECD 結合（SI 附錄，圖 S10）。相比之下，與 GLP-1R ECD 的結合對 tirzepatide (K _D = 23 nM) 的親和力顯著高于 tirzepatide ^ΔC20 (K _D = 111 nM) ( SI 附錄，圖 S10 )，這表明通過脂質(zhì)部分可以通過與 GLP-1R 的 ECD 的相互作用來解釋。

然后使用非 G 蛋白信號的測定來進一步研究 tirzepatide 在 GLP-1R 上的不同藥理學。與先前的結果一致，顯示 tirzepatide 誘導的 β-arrestin 募集到 GLP-1R ( 10 ) 的低功效/部分激動作用，tirzepatide 在募集 G 蛋白偶聯(lián)受體激酶 2 (GRK2) 方面表現(xiàn)出相似的特征（圖 5 A和B），它通過磷酸化受體來幫助終止信號傳導，從而使 β-arrestins 能夠結合（32）。在兩種測定中對 tirzepatide 類似物的研究揭示了非酰化母體肽的募集功效適度增加，并且使用還包含酪氨酸-組氨酸替代物的配體實現(xiàn)了幾乎全部功效（圖 5 A和B）。由于激動劑誘導的受體內(nèi)化通常由 β-抑制蛋白轉(zhuǎn)運介導，因此使用 N 末端 SNAP-tag 系統(tǒng)評估類似物的 GLP-1R 內(nèi)化。在這些實驗中，在沒有脂質(zhì)的情況下，tirzepatide 誘導 GLP-1R 內(nèi)化的效力和功效均大大增加（圖 5C ）。第一個位置有組氨酸的配體 (TZP ^ΔC20,Y1H) 顯示出進一步的輕微改善，導致在測定中與 GLP-1 等效（圖 5C ）。

為了將這些發(fā)現(xiàn)擴展到異源細胞系統(tǒng)之外，合成了熒光標記的肽并將其用于正交實驗以可視化胰島中配體誘導的受體內(nèi)化。在這些研究中，GLP-1 ^AF647、tirzepatide ^AF647、tirzepatide ^{ΔC20、Y1H-AF647}或 (D-Ala2)GIPR ^AF488在從野生型或Glp-1r缺失小鼠中分離的胰島的靜態(tài)培養(yǎng)物中孵育。共聚焦顯微鏡成像顯示用標記的 GLP-1（圖 5 D）或 tirzepatide ^ΔC20,Y1H（圖 5 J ）處理) 導致部分配體在細胞內(nèi)以點狀熒光信號的形式出現(xiàn)在胰島細胞的細胞質(zhì)和核周區(qū)域中。標記的 GLP-1 和 tirzepatide ^ΔC20、Y1H的細胞內(nèi)熒光強度分別為 104.5 ± 7.5 SEM ( n = 22) 和 85.3 ± 5.9 SEM ( n = 16)。然而，用 tirzepatide ^AF647孵育的胰島細胞內(nèi)熒光強度僅為 46.0 ± 3.6 SEM ( n = 30) (圖 5 G )。作為對照，用 GLP-1R 拮抗劑 exendin-4 _(9-39) (圖 5 E、H和K ) 或來自Glp-1r無效小鼠（圖 5 F、I和L ）顯示可忽略不計的細胞內(nèi)熒光（在n ≥ 13時強度≤4.0 ），支持 GLP-1R 介導的配體內(nèi)化機制。值得注意的是，熒光標記的 semaglutide 在處理過的胰島中顯示出與標記的 GLP-1 相似的細胞內(nèi)染色（SI 附錄，圖 S11），這支持了脂質(zhì)修飾通常不會阻止配體內(nèi)化的觀點。此外，我們推測缺乏明顯的 GIPR 介導的配體內(nèi)化是由于 GIP 內(nèi)化程度的差異，正如先前報道的那樣 ( 10 , 33)，和/或方法的靈敏度。總體而言，tirzepatide 通過 GRK2/β-arrestin 募集引起 GLP-1R 脫敏的能力有限，這與其無法誘導 GLP-1R 內(nèi)化一致。

本報告中的研究共同調(diào)查了替西帕肽獨特藥理學特征的分子機制和結構決定因素。總體研究結果的總和指向一個模型，其中 GLP-1R 的偏向激動是由多種機制驅(qū)動的。與 tirzepatide 的 N 末端的關鍵相互作用與協(xié)調(diào)受體激活所必需的變構轉(zhuǎn)變有關，其他偏向配體的情況也是如此 ( 24 , 29 , 34 )。與先前的研究一致 ( 35 , 36)，我們觀察到，tirzepatide C 末端的 exendin-4 同源序列促進了與 GLP-1R 相對于 GIPR 的高親和力相互作用。由于 B 類肽結合的經(jīng)典兩步機制的性質(zhì) ( 31 )，tirzepatide 的 ECD 驅(qū)動的親和力可能為 N 末端殘基修飾帶來藥理學機會，同時保持全長受體結合親和力。規(guī)范 B 類 GPCR 配體的 N 末端的修飾已被充分證明可以改變傳感器的功效 ( 14 , 37 – 39 )。最近對 B 類 GPCR 激活的見解表明，異源三聚體 G 蛋白的激活是一種復雜的多步驟機制 ( 40 , 41），但關于β-抑制蛋白募集的機制尚不清楚。我們之前觀察到，tirzepatide 在 GLP-1R ( 10 ) 處對 G 蛋白活化表現(xiàn)出部分激動作用，這可能代表了偏向激動劑藥理學的核心機制。

總之，肽療法代表了一種越來越重要的藥物發(fā)現(xiàn)方式（42）。通常，脂肪酸修飾被用作提高肽的體內(nèi)半衰期的有效方法。這在很大程度上是因為?；呐c血清白蛋白的結合保護了它們免受蛋白水解和排泄。我們證明肽結構活性關系（SAR）受受體和信號轉(zhuǎn)導依賴方式的?；绊?決定。因此，替西帕肽的藥理學特征由肽序列和脂質(zhì)部分的存在共同決定。獨特的是，tirzepatide 與酪氨酸 1 組合的脂質(zhì)修飾是降低 tirzepatide 對 GRK2 和 β-arrestin 募集以及因此被 GLP-1R 內(nèi)化的功效的關鍵特征。出奇，?；淖饔檬遣煌?，因為分子的非肽部分降低了 GIPR 的親和力，但降低了 GLP-1R 的功效。對肽和脂質(zhì)修飾的 SAR 可以驅(qū)動微妙但潛在的顯著藥理作用（部分或偏向激動）的認識表明，新療法的設計應包含更廣泛的藥理學、結構和計算方法，以了解兩者之間的復雜相互作用。受體和?；乃幬?。

方法

配體。

所有肽均在 Eli Lilly and Company 使用標準固相肽合成方法合成，該方法采用 Fmoc 保護基團策略，使用載量為 0.35 至 0.88 mmol/g 的 Rink-酰胺樹脂。通過摻入 FMOC -L獲得含有接頭-脂肪酸修飾的類似物-Lys(Mtt)-OH 殘基在適當位置，與 N 末端殘基的 Boc 保護串聯(lián)。在使用標準 Fmoc 化學逐步合成接頭-脂肪酸基團之前，通過在二氯甲烷中用 30% 六氟異丙醇處理實現(xiàn) Mtt 保護基的正交去除。合成完成后，通過用三氟乙酸 (TFA)/水/三異丙基硅烷/1,2-乙二硫醇 (EDT) (85:5:5:5) 處理 2 小時，將肽從樹脂上裂解下來，然后沉淀和用冷乙醚洗滌。肽通過反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 使用乙腈和含有 0.1% TFA 的水梯度純化，純度≥95%。選擇的類似物在其 C 末端進行熒光標記，首先通過摻入一個額外的 C 末端 Fmoc-L -Lys(Mtt)-OH 殘基，在剩余序列的合成和如上所述的純化之前，類似地用炔丙基-PEG2-酸(Broadpharm)進行去保護和功能化。然后使用銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成化學在水/二甲基甲酰胺 (1:1) 中將所得的炔標記肽前體與 AFDye 647 疊氮化物 (Click Chemistry Tools) 或 AFDye 488 疊氮化物 (Sigma Aldrich) 綴合，并通過 RP-再純化高效液相色譜法。正變構調(diào)節(jié)劑 (PAM) 如下： LSN3451217 (4-[(3 S )-2-[(2-羥基-4-異丙基-苯基)甲基]-6-甲氧基-3-(甲氧基甲基)-3, 4-二氫-1H-異喹啉-5-基]-2-甲基苯酚鹽酸鹽）和LSN3556672（2-氟-6-（異丁基氨基）-4-[(1 R )-2-[(1 S ))-1-(4-異丙基苯基)乙基]-6-甲氧基-1-甲基-3,4-二氫-1H-異喹啉-5-基]苯酚二鹽酸鹽)。這些化合物分別是 GLP-1R 和 GIPR 的調(diào)節(jié)劑，用于幫助形成穩(wěn)定的 tirzepatide 與受體復合物。

構建體和昆蟲細胞表達。

將人 GIPR（殘基 24 到 466）和 GLP-1R（殘基 24 到 422）cDNA 亞克隆到含有 N 端 FLAG 標簽和 3C 蛋白酶位點的 pFastBac1 載體中。用根據(jù)制造商的方案生產(chǎn)的 P2 病毒感染 Sf9 細胞以產(chǎn)生表達 GIPR 和 GLP-1R 的細胞團塊。人 Gsα 亞基經(jīng)過修飾，其 N 末端的 1 至 25 個殘基被人 Gαi 的 1 至 18 個殘基取代，以允許單鏈可變片段 scFv16 作為穩(wěn)定伴侶結合 ( 43）。這種名為 GsαiN18 的構建體被克隆到 pVL1392 中。將人 Gβ1 和 Gγ2 克隆到同一載體上的 pFastBac Dual 中。P2 病毒原液是根據(jù)制造商的方案生產(chǎn)的。Hi-5 細胞被 GsαiN18 和 Gβ1-Gγ2 病毒感染以產(chǎn)生異源三聚體 GsiN18 蛋白細胞團塊。

復雜的形成和純化。

GIPR/GIP 復合物和 GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 復合物是用類似的策略形成和純化的，因此一起描述。記錄了特定于單個樣本的步驟和細節(jié)。異三聚體 GsiN18 通過 Ni 親和柱和離子交換色譜法 ( 44 ) 進行純化。scFv16 和 Nb35 如前所述生產(chǎn) ( 43 , 44）。受體/G蛋白復合物（在下文中稱為復合物）在膜中形成。為了制備復合樣品，將表達相應受體的 Sf9 細胞團塊裂解，收集并清洗膜樣品。通過將純化摩爾過量的異源三聚體 GsiN18、Nb35、scFv16 和 10 μM 的相應肽（GIP 或 tirzepatide）與膜孵育過夜，形成復合物。對于 GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 樣品，分別添加了 10 μM LSN3556672 和 LSN3451217。將樣品溶解在由 1% DDM、0.5% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-丙磺酸水合物、0.2% 膽固醇半琥珀酸酯 (CHS)、30 mM Hepes (pH 7.8)、150 mM NaCl、30 % 甘油，25 μM 三（2-羧乙基）膦，2.5 mg/mL 亮肽素，0.16 mg/mL 苯甲脒，GIPR/tirzepatide 和 GLP-1R/tirzepatide 樣品的 1 μM 肽和 2 μM 各自的 PAM。然后使用抗-FLAG M1樹脂通過親和層析純化復合物。對于 GIPR/GIP 和 GIPR/tirzepatide 純化，用含有高（1% DDM、0.5% CHAPS、0.2% CHS）和低（0.1% DDM、0.05% CHAPS、0.02% CHS）洗滌劑濃度的緩沖液洗滌樹脂，或者. 緩沖液的其他成分相同，如下所示：30 mM Hepes (pH 7.8)、150 mM NaCl、10% 甘油、25 μM TCEP、1 μM tirzepatide 和 2 μM PAM。每個緩沖液使用的體積是 12 個柱體積。對于 GLP-1R/tirzepatide 樣品，用 10 個柱體積的 0.1% DDM、0.05% CHAPS、0.02% CHS、30 mM Hepes pH 7.8、150 mM NaCl、10% 甘油、25 μM TCEP、1 μM 洗滌樹脂tirzepatide 和 2 μM 的 PAM。洗完后，樣品在由 30 mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、2.5 mM CaCl2、1 μM 相應肽、2 μM 相應 PAM、25 μM TCEP、0.25% 組成的緩沖液中逐步交換月桂基麥芽糖新戊二醇 (MNG; NG310 Anatrace)、0.25% GDN101 (Anatrace)、0.048% 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-1'-rac-glycerol (POPG; Avanti) 和 0.03 ％膽固醇（Sigma-Aldrich）。使用 Superdex S200 10/300 GL 柱，使用具有 30 mM Hepes (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 μM 相應肽和 2 μM 相應 PAM 的運行緩沖液的 Superdex S200 10/300 GL 柱洗脫和進一步純化復合物， 100 μM TCEP、0.015% MNG、0.005% GDN101、0.00192% POPG 和 0.0012% 膽固醇。收集單體復合物的部分并單獨濃縮用于電子顯微鏡實驗。

Cryo-EM 數(shù)據(jù)采集和處理。

將濃度約為 10 mg/mL 的 3.5 μL 純化復合物樣品應用于輝光放電多孔碳網(wǎng)格（Quantifoil R1.2/1.3, 200 目），隨后使用 Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）進行玻璃化。使用帶有能量過濾器的 Titan Krios 電子顯微鏡 (Thermo Fisher Scientific) 使用 K3 Summit 直接電子檢測器 (Gatan, Inc.) 在計數(shù)模式下在 300 kV 加速電壓下工作，使樣本可視化。數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示在SI 附錄表 S1中。

數(shù)據(jù)處理在 Relion3.1 ( 45 ) 中進行。使用 MotionCor2 ( 46 )對劑量分割的圖像堆棧進行光束誘導運動校正。每張顯微照片的對比度傳遞函數(shù) (CTF) 參數(shù)由 Gctf ( 47 ) 確定。在后續(xù)步驟之前，根據(jù)其質(zhì)量和 CTF 估計分辨率手動選擇顯微照片。在像素大小為 1.64 ? 的分箱數(shù)據(jù)集上執(zhí)行具有二維 (2D) 和 3D 分類的粒子選擇。使用來自先前報道的 GLP-1R/GLP-1/Gs/Nb35 復合物的模板進行半自動粒子選擇（16); 這些粒子進行了 2D 和 3D 分類。在 3D 分類之后，選擇生成最佳 3D 地圖的粒子類別，并將這些粒子的未合并版本用作 3D 自動細化的輸入。應用貝葉斯拋光和 CTF 細化 ( 48 ) 來進一步改進地圖。單個樣品的流程圖顯示在SI 附錄中，無花果。S1 和 S2。報告的分辨率基于使用 0.143 標準的金標準傅立葉殼相關性（SI 附錄，圖 S1 和 S2）。

模型構建和細化。

通過報告的 GLP-1R/GLP-1/Gs/Nb35 結構（RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫代碼 6VCB）的剛體擬合完成初始模型構建。當適用于各自的模型時，該序列被突變以匹配 GIPR、GIP 或 tirzepatide。然后，初始模型分別在 Coot ( 49 , 50 ) 和 Phenix ( 51 )中進行迭代的手動和真實空間細化。目視檢查最終模型與地圖的總體擬合，并使用 Molprobity ( 52 ) 進一步評估幾何形狀。模型的最終細化統(tǒng)計數(shù)據(jù)匯總在SI 附錄表 S1中。

原子坐標和低溫電磁密度圖已保存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (PDB) 和電子顯微鏡數(shù)據(jù)庫 (EMDB) 中。登錄號如下：GIPR/GIP（PDB：7RA3；EMDB：EMD-24334）、GIPR/tirzepatide（PDB：7RBT；EMDB：EMD-24401）、GLP-1R/tirzepatide（PDB：7RGP；EMDB：EMD） -24453）和 GLP-1R apo 形式（PDB：7RG9；EMDB：EMD-24445）。

MD 模擬。

使用同源建模過程和 MOE（分子操作環(huán)境）。^{與 Lys20 Tzp}綴合的接頭-脂肪酸脂質(zhì)鏈和在冷凍電鏡結構中未觀察到的 C 末端 33 至 39 個殘基被建模為擴展構象，并遠離受體作為初始結構模型，以避免引入與受體的人為偏向相互作用。使用薛定諤軟件（202.3 版），用受約束的重原子進一步將復雜結構的能量最小化。然后將具有3點水和磷脂酰膽堿膜的可轉(zhuǎn)移分子間電位添加到運行MD的復雜系統(tǒng)中。膜位置設置為GIPR中受體殘基136至159、172至193、215至239、258至280、294至318、339至362和372至395；和 GLP-1R 中的 143 至 165、179 至 200、225 至 249、268 至 290、304 至 329、350 至 373 和 381 至 405。² ))，受體、肽和調(diào)節(jié)劑的ECD不受限制。系統(tǒng)包含 220K 原子，并且使用 OPLS3e 力場 ( 53 ) 使用 Desmond MD 包運行模擬。進行了分析，忽略了軌跡的前 10 納秒。在模擬過程中監(jiān)測回轉(zhuǎn)半徑、氫鍵和極性表面積。所有 MD 模擬和分析均使用 Schrodinger 軟件（版本 2020.3）在 V100 Nvidia 圖形處理單元上進行。

體外藥理學。

重組人 GIPR 和 GLP-1R 表達細胞系、cAMP 積累測定、[ ³⁵ S]GTPγS 結合測定、NanoBRET β-arrestin 1 募集和 [ ¹²⁵ I]-GLP-1(7-36)NH ₂和 [ ¹²⁵ I ]-GIP ( 1 – 42 ) 放射性配體結合研究完全按照參考文獻10中的描述進行。

GRK2 對 GLP-1R 的募集通過 NanoBRET 方法進行量化（54）。基于 pcDNA3.1 的載體編碼 NanoLuc，融合到 GRK2 的 N 端 (NP_001610) 以及 GLP-1R 和 HaloTag 的 C 端融合，用于轉(zhuǎn)染自由式 HEK 細胞 ( 55 )。48 小時后，將轉(zhuǎn)染的細胞在含有 0.1% (wt/vol) 牛酪蛋白和不同濃度配體的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中孵育。使用 Nano-Glo 底物作為供體和 NanoBRET 618 配體作為受體啟動生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 (BRET)。在 460 nm 和 610 nm 處測量發(fā)射，并計算 BRET 比率。將融合蛋白的配體誘導的相互作用作為最大 GLP-1 的百分比與配體濃度作圖。

為了評估配體誘導的受體內(nèi)化，表達 SNAP-GLP-1R 的 HEK293 細胞用 100 nM Tag-Lite SNAP-Lumi4-Tb（供體）標記，洗滌并在含有 100 μM 熒光素-O' 乙酸的 Opti-MEM 中孵育（受體）。然后加入不同濃度的配體，并將混合物在 5% CO ₂ /37 °C 下孵育。使用 EnVision 讀板器收集數(shù)據(jù)。將與最大 GLP-1 相比的內(nèi)化百分比與配體濃度作圖。先前報道了上述程序的其他實驗細節(jié)（10）。所有測定的數(shù)據(jù)均符合 Genedata Screener 17 或 GraphPad Prism 9 軟件中的四參數(shù)邏輯模型。

ECD 結合試驗。

分離的人 GIPR（氨基酸 26 至 138）和 GLP-1R（氨基酸 24 至 145）的 ECD 在 CHO 細胞中表達為 6His 標記的分泌蛋白。將編碼每種蛋白質(zhì)的 DNA 轉(zhuǎn)染到 CHO 細胞中進行表達。表達后，通過親和色譜法（HIS-Trap Ni，Cytiva）純化蛋白質(zhì)，然后使用帶有 PBS 緩沖液的 HiLoad 26/600 Superdex 75pg 柱（Cytiva）進行尺寸排阻色譜法。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析級分，合并符合純化標準的級分，然后過濾0.22μm。使用 Biacore T200 (Cytiva) 進行表面等離子體共振測量，并使用 T200 評估軟件版本 3.1 進行分析。使用 Biacore T200 控制軟件 2.0.2 版中的胺偶聯(lián)固定向?qū)⑹荏w胞外域蛋白共價固定（~250 個共振單位）在傳感器芯片 CM4 BR100534 上。運行緩沖液為 HBS-EP（10 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% P20 [pH 7.6]；Teknova）。通過在運行緩沖液中連續(xù)稀釋來制備每個樣品的濃度系列。樣品以 30-μL/min 的流速注入 150 秒，然后解離 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在樣品之間再生表面。樣品以 30-μL/min 的流速注入 150 秒，然后解離 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在樣品之間再生表面。樣品以 30-μL/min 的流速注入 150 秒，然后解離 300 秒。用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 在樣品之間再生表面。

胰島的標簽。

如前所述 ( 56 ) 分離小鼠和大鼠胰島，使其在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基 (Gibco) 中恢復 48 小時，然后使用 Cell Tak 細胞粘合劑 (Corning ) 在含有 0.5% FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在 5% CO ₂ /37 °C 下培養(yǎng) 120 分鐘。對于受體特異性，在粘附階段的最后一小時，將一部分胰島與 2 μM exendin-4 _(9-39)一起孵育以評估 GLP-1R 結合。胰島在含有 0.1% 酪蛋白的 Hank 平衡鹽溶液和 5% CO _{2的檢測緩沖液中用熒光配體（10 至 30 nM）標記 30 分鐘}/37 °C。背景熒光在僅與測定緩沖液一起孵育的胰島上測定。標記后，用 PBS 快速洗滌胰島兩次以去除未結合的熒光，然后立即將其固定在 4% 多聚甲醛、0.1% Tween20 和 0.4 μg/mL Hoechst 33342 中，在室溫下放置 30 分鐘。使用帶有 63× 油物鏡的 Zeiss LSM800 共聚焦顯微鏡對小鼠胰島進行成像。對于大鼠胰島，固定后，胰島在室溫下用 125 nM AlexaFluor488 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）染色 20 分鐘以檢測細胞膜。然后，在 LSM800 上使用 Airyscan 拍攝圖像，并使用 Zen 軟件（Blue edition 2.3 lite，Zeiss）進行解卷積。定量也使用 Zen 軟件完成。使用直徑為 5 μm 的圓形工具在核周區(qū)域測量單個胰島細胞的細胞內(nèi)熒光強度。通過減去從載體處理的胰島記錄的熒光強度來校正背景強度值。從兩到五個單獨的胰島圖像中從至少四個單獨的細胞中采集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)報告為平均值±SEM。

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意義

抽象的

結果和討論

Tirzepatide 與 GIPR 和 GLP-1R 復合的低溫電子顯微鏡 (Cryo-EM) 結構。

Tirzepatide 的接頭-脂肪酸部分的動力學。

替西帕肽功能的藥理學基礎。

方法

配體。

構建體和昆蟲細胞表達。

復雜的形成和純化。

Cryo-EM 數(shù)據(jù)采集和處理。

模型構建和細化。

MD 模擬。

體外藥理學。

ECD 結合試驗。

胰島的標簽。

替西帕肽功能的藥理學基礎。

配體。

復雜的形成和純化。

Cryo-EM 數(shù)據(jù)采集和處理。

MD 模擬。

體外藥理學。

胰島的標簽。