在全球范圍內(nèi)，肝臟腫瘤（肝細胞癌，HCC）發(fā)生率持續(xù)增加，成為危害公共健康的重要因素[1]。有預測顯示，在2025年以前，每年將有超過一百萬新增HCC患者[2]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年我國HCC發(fā)生率高居世界第八位，而在我國所有癌癥中，HCC發(fā)病率位居第五位，死亡率位居第二位，HCC的防控及治療刻不容緩！
在過去的五年中，免疫檢查點抑制劑（ICI）為HCC治療帶來了巨大的變革。相較于傳統(tǒng)的HCC一線治療藥物索拉非尼，多種聯(lián)合治療方案，如阿替利珠單抗（PD-L1）和貝伐珠單抗（VEGF-A）的聯(lián)合治療、度伐利尤單抗（PD-L1）和Tremelimumab（CTLA-4）的聯(lián)合治療、阿替利珠單抗和Cabozantinib（多靶點酪氨酸酶抑制劑）的聯(lián)合治療等等，均取得了更好的治療效果。除此之外，納武利尤單抗（PD-1）和伊匹木單抗（CTLA-4）的聯(lián)合治療方案、帕博利珠單抗（PD-1）的單一治療方案更是因其出色的早期臨床數(shù)據(jù)，進入美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的快速審批通道[3]。
然而，亞洲的HCC患者對ICI治療方案的客觀響應率（ORR）并不理想[4]，因此，了解HCC免疫抑制微環(huán)境具有極其重要的意義，如何打破免疫治療耐受，并開發(fā)新型免疫治療方案成為重中之重。
近日，復旦大學附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、復旦大學基礎醫(yī)學院藥理學系朱棣，以及復旦大學附屬中山醫(yī)院徐泱團隊合作，在著名期刊Cancer Discovery發(fā)表重要研究成果。
他們利用HCC患者的臨床研究和小鼠HCC模型，發(fā)現(xiàn)干擾素（IFN）-α通過調(diào)控HCC細胞中FosB的轉(zhuǎn)錄活動，抑制缺氧誘導因子HIF1α，從而抑制HCC細胞糖酵解，降低對葡萄糖的攝取，重塑并形成富含葡萄糖的腫瘤微環(huán)境（TME）；高葡萄糖的TME 促進T細胞mTOR-FOXM1信號通路活化，使腫瘤浸潤CD8+T細胞高表達共刺激分子CD27，增強其殺傷功能，放大PD-1阻斷對HCC的治療效果[5]。更重要的是，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案在HCC患者中具有較高的響應率，并顯著抑制HCC的疾病進展。
他們的研究成果為開辟HCC新型免疫治療方案提供了堅實可靠的理論基礎，其取得的前期臨床試驗成果令人興奮不已！復旦大學附屬中山醫(yī)院胡博主治醫(yī)師、中山醫(yī)院喻敏成博士研究生、中山醫(yī)院馬曉路博士、中山醫(yī)院孫嘉磊博士研究生、藥學院劉成龍博士研究生為該文共同第一作者。
接下來咱們就一起看看，樊嘉院士/朱棣/徐泱團隊是如何探索IFN-α+PD-1阻斷對HCC的治療效果及其背后的免疫學機制。
IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療顯著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展
為了觀察IFN-α+PD-1阻斷的聯(lián)合治療效果，研究人員觀察了15例無法進行手術切除的肝癌患者，并給予IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療。令人驚訝的是，聯(lián)合治療后ORR為40.0%，疾病控制率（DCR）高達80.0%，同時沒有出現(xiàn)因治療導致的死亡病例。
其中1號患者是一名67歲的女性，曾做過動脈插管化療栓塞術（TACE），并隨后接受PD-1阻斷治療，但是臨床反應較小，最終導致疾病持續(xù)加重。該患者肝臟中最大的腫瘤 （2.3×4.1 厘米）位于 VIII 節(jié)段，靠近肝門靜脈分支。然而，經(jīng)過7周的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，該患者的腫瘤出現(xiàn)壞死，其體積顯著變小。在后期的隨訪觀察中，該患者的腫瘤大小也未增加，同時也沒有出現(xiàn)副作用。
2號患者是一名34歲的男性，其肝癌十分巨大。該患者經(jīng)過多次TACE治療和兩次肝切除，隨后也接受PD-1阻斷治療。在治療后的一年內(nèi)，該患者并未出現(xiàn)明顯的肝癌復發(fā)跡象。但兩年后，該患者出現(xiàn)呼吸困難的癥狀，經(jīng)CT檢測發(fā)現(xiàn)，肺臟出現(xiàn)10個以上的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。值得慶幸的是，經(jīng)過兩個月的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，CT檢測發(fā)現(xiàn)該患者肺臟中的多個腫瘤轉(zhuǎn)移灶被完全清除，同時最大的腫瘤結節(jié)（1.4厘米）顯著縮小，也沒有出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶。
IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療促進CD27+CD8+T細胞比例
為了探究IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案的免疫學機制，研究人員利用肝癌細胞系Hepa1-6細胞和H22細胞構建原位同基因小鼠肝癌模型。結果發(fā)現(xiàn)，相較于IFN-α或PD-1阻斷等單一治療，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時，荷瘤小鼠生存期明顯延長。更重要的是，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠誘導腫瘤壞死，進而完全清除肺臟中的轉(zhuǎn)移灶。進一步分析發(fā)現(xiàn)IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療依賴健全的免疫系統(tǒng)，同時IFN-α直接作用于表達其受體（IFNAR1）的HCC細胞。
為了解IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療對TME中浸潤的免疫細胞的影響，研究人員分離腫瘤組織中的CD45+免疫細胞，并使用質(zhì)譜流式（CyTOF），檢測了42種細胞表面或胞內(nèi)的免疫指標。結果發(fā)現(xiàn)，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著降低耗竭CD8+T細胞前體的數(shù)量。
接下來，研究人員對Hepa1-6荷瘤小鼠進行了CD4+T細胞和CD8+T細胞的清除實驗。結果發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞在其中發(fā)揮了重要作用。結合CyTOF和多色免疫熒光的檢測結果，研究人員觀察到經(jīng)過IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療后，腫瘤組織中CD27+CD8+T細胞亞群的數(shù)量顯著增加。除此之外，研究人員將HCC患者培育的類器官（PDO）與自體的腫瘤浸潤免疫細胞共培養(yǎng)，也觀察到了類似的現(xiàn)象，即IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理能夠在最大程度上增加CD8+T細胞上CD27的表達。
那么，CD27表達是否能夠促進CD8+T細胞的抗腫瘤功能呢？為此，研究人員利用Cd27特異性的siRNA，敲低腫瘤浸潤CD8+T細胞上CD27的表達。與預期的一致，CD27下降后，CD8+T細胞分泌炎性細胞因子和細胞毒性顆粒的能力顯著降低。同時，HCC患者腫瘤組織的單細胞測序結果也證實，CD27highCD8+T細胞上細胞毒性和增殖相關的基因表達水平也明顯增加。有趣的是，HCC患者腫瘤組織中的CD27highCD8+T細胞上PD-1的表達亦高于CD27lowCD8+T細胞。
以上結果暗示CD27+CD8+T細胞亞群可能在IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療的過程扮演了重要角色。
IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療抑制腫瘤細胞糖酵解
基因集富集分析（GSEA）和免疫印跡實驗均證實，阻斷PD-1會促進腫瘤細胞中的HIF1α信號通路，然而，聯(lián)合治療則顯著抑制HIF1α信號通路。與腫瘤細胞相反的是，腫瘤浸潤CD8+T細胞在經(jīng)過PD-1阻斷后，HIF1α及其下游分子的表達有所下降，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理則會起到相反的結果，導致CD8+T細胞攝取葡萄糖的能力增強，從而促進其增殖和活化。
IFN-α通過IRF1-FosB信號軸負調(diào)HIF1α
HIF1α在糖酵解過程中發(fā)揮了重要作用，因此研究人員進行了細胞外酸化率（ECAR）實驗。與HIF1α信號通路的變化一致，阻斷PD-1能夠促進腫瘤細胞糖酵解，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理會顯著抑制腫瘤細胞糖酵解。在CD8+T細胞中得到了截然相反的結果。并且，阻斷PD-1后，TME中葡萄糖含量明顯降低，而IFN-α處理則會逆轉(zhuǎn)這一變化。
IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療活化mTOR-FOXM1信號通路
深入研究發(fā)現(xiàn)IFN-α處理會促進腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄因子IRF1的表達，并使其向核內(nèi)聚集，繼而抑制促癌基因FosB的表達，而FosB會與HIF1α結合，導致HIF1α無法繼續(xù)促進糖酵解相關基因的表達，如Pfkl，Hk1，Pkm2和Ldha等等，最后造成腫瘤細胞糖酵解能力下降，形成葡萄糖含量變高的TME。
TME中葡萄糖含量越高，CD8+T細胞中p-mTOR、HIF1α、PKM2、LDHA和CD27等分子的蛋白水平越高，并且，這一過程依賴mTOR信號通路。為了研究mTOR對CD27的調(diào)控作用，研究人員利用信號通路計劃（SPP）數(shù)據(jù)庫，預測人白細胞中調(diào)控CD27的轉(zhuǎn)錄因子，并與單細胞數(shù)據(jù)進行整合分析。發(fā)現(xiàn)CD27highCD8+T細胞高表達FOXM1。雖然在穩(wěn)態(tài)下，CD8+T細胞過表達Foxm1，不能增加CD27+CD8+T細胞的比例，但會顯著促進CD8+T細胞分泌IFN-γ和IL-2。
有意思的是，CD8+T細胞中FOXM1的表達在IFN-α處理后會明顯增加，而IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合處理則會進一步放大這一現(xiàn)象。除此之外，高葡萄糖培養(yǎng)基也會促進FOXM1表達。相反的是， mTOR抑制劑或HIF1α抑制劑則會逆轉(zhuǎn)FOXM1的表達。
隨后，研究人員用IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療荷瘤小鼠，并分離腫瘤浸潤的CD8+T細胞，過表達和敲低實驗均證實FOXM1能夠促進CD8+T細胞表達CD27。除此之外，研究人員在HCC的TCGA數(shù)據(jù)庫和單細胞測序數(shù)據(jù)中也看到了類似的現(xiàn)象，即CD27和FOXM1表達水平呈明顯正相關。
CD27和CD8是HCC患者良好預后的重要指標
以上結果證實IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療會重塑TME，使得微環(huán)境中葡萄糖含量增加，激活CD8+T細胞中的mTOR信號通路，提高FOXM1表達水平，從而增強Cd27轉(zhuǎn)錄。
最后研究人員對HCC患者進行生存期預后分析，發(fā)現(xiàn)CD27highCD8high的細胞越多，患者的無進展生存期和總生存期越長，預后也越好。不僅如此， HCC患者經(jīng)過PD-1阻斷治療后，有響應的患者往往存在更多的腫瘤浸潤CD27+CD8+淋巴細胞。
總的來說，樊嘉院士/朱棣/徐泱的研究團隊發(fā)現(xiàn)，IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療能夠顯著抑制肝癌小鼠或HCC病人中的腫瘤生長。深入研究證實，IFN-α會誘導HCC細胞中IRF1表達，繼而抑制FosB轉(zhuǎn)錄，導致HIF1α的轉(zhuǎn)錄活動被抑制，使得HCC細胞糖酵解能力下降，重塑TME。富含葡萄糖的TME又會活化CD8+T細胞的mTOR-FOXM1信號通路，導致共刺激分子CD27表達增加，促進CD8+T細胞的腫瘤免疫監(jiān)視功能。
文章內(nèi)容總結圖
樊嘉院士及其團隊任重而道遠，他們設計的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案仍不成熟，比如，應擴大HCC臨床患者群體，以檢驗IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療的臨床價值；需要系統(tǒng)性評估該治療方案的不良反應；同時，還應探索IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療對其它類型腫瘤的治療效果。
但是，毫無疑問，樊嘉院士/朱棣/徐泱團隊推出的IFN-α+PD-1阻斷聯(lián)合治療方案振奮人心、令人激動！他們的初期臨床試驗和小鼠動物模型得到的效果也十分顯著、意義重大！希望后續(xù)的相關臨床試驗也同樣出色，為腫瘤的免疫學治療做出里程碑式的貢獻，也為廣大腫瘤患者帶來真正的希望！
