結(jié)直腸癌（CRC）是世界第三高發(fā)癌癥。
CRC的發(fā)生發(fā)展遵循明確的規(guī)律，即由腸息肉轉(zhuǎn)變?yōu)橄倭?，最后轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔?/p>
據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%的CRC帶有抑癌基因APC缺失或功能喪失型突變。在腫瘤發(fā)生早期，APC突變會(huì)導(dǎo)致WNT通路上調(diào)以及腸上皮細(xì)胞增生。隨后，其他癌癥驅(qū)動(dòng)基因激活（例如KRAS突變），或抑癌基因失活（例如TP53突變），會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[1]。
目前，大部分CRC的研究著重于對(duì)晚期腫瘤的分析，而且分析精度局限于腫瘤整體層面，忽略了對(duì)腫瘤早期發(fā)展過(guò)程以及腫瘤微環(huán)境的關(guān)注。因此，腸上皮細(xì)胞癌變的過(guò)程，及在此過(guò)程中組織微環(huán)境中其他組分的功能，是當(dāng)前CRC領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
近日，由斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Michael P. Snyder 和Willian J. Greenleaf領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，在《自然·遺傳學(xué)》期刊發(fā)表了關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程的重要研究成果[2]。
該研究團(tuán)隊(duì)收集了27個(gè)正常腸組織，48個(gè)腸息肉和6個(gè)CRC樣本。利用這些組織，研究人員在單細(xì)胞層面建立了正常腸組織→腸息肉→CRC的轉(zhuǎn)化過(guò)程中的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組圖譜。
他們不僅發(fā)現(xiàn)腸息肉和CRC組織中都存在一群新的具有干細(xì)胞表型的上皮細(xì)胞群體，還在高級(jí)別的息肉中發(fā)現(xiàn)了富集的干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞，以及腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞（Tregs）和癌前相關(guān)成纖維細(xì)胞（preCAFs）也有所增加。
該研究第一次在單細(xì)胞層面描述了CRC癌前轉(zhuǎn)化的特征，分析了造成這些特征變化的分子機(jī)制，填補(bǔ)了對(duì)CRC癌前轉(zhuǎn)化的研究的缺失，并為癌前病變的分期和癌癥風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)提供了詳細(xì)的參考。
由于APC突變?cè)贑RC中極為普遍，而且對(duì)CRC的早期發(fā)生至關(guān)重要，因此該團(tuán)隊(duì)決定利用由APC胚系突變導(dǎo)致的家族性腺瘤性息肉病（FAP）作為研究模型。FAP患者的特征是其結(jié)腸內(nèi)會(huì)形成超過(guò)100枚具有不同分期和分子層面差異的腺瘤性息肉，且這些息肉大部分會(huì)發(fā)展為CRC。
為了更全面地了解腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，研究人員收集了健康人的結(jié)腸組織，F(xiàn)AP及非FAP患者的腸息肉和CRC組織。研究人員利用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（snRNA-seq）和單細(xì)胞染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序（scATAC-seq），來(lái)分析和比較不同階段組織的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的差異。
研究人員首先簡(jiǎn)單地將組織中的細(xì)胞分為上皮細(xì)胞，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。在聚集分析中，來(lái)源于不同組織的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的聚集性。而上皮細(xì)胞則呈分散式分布，形成正常組織，息肉和CRC亞群。因此，研究人員將不同組織中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別作為整體進(jìn)行分析，而將來(lái)源于不同組織的上皮細(xì)胞分別進(jìn)行分析。
隨后，研究人員參考已知標(biāo)志基因的表達(dá)狀態(tài)，對(duì)snRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，同時(shí)利用標(biāo)志基因的染色體活躍值（在一個(gè)基因區(qū)域的染色體可及性程度）對(duì)scATAC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。
基于scATAC-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)了一群CRC中特有的耗竭性T細(xì)胞。這群細(xì)胞的T細(xì)胞耗竭標(biāo)志基因區(qū)域有高染色體活躍值，同時(shí)在耗竭性T細(xì)胞特有的DNA基序區(qū)域（例如NR4A，RUNX，CEFB，JUN，F(xiàn)OS和BATF）也有高染色體可及性。
另外，snRNA-seq和scATAC-seq都顯示，相對(duì)于正常組織，息肉和CRC中富集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs），而且這些Tregs在息肉到CRC轉(zhuǎn)換中持續(xù)增加，提示這些Tregs可能參與癌前轉(zhuǎn)化的免疫逃逸。與這些Tregs相反，息肉和CRC中的初始B細(xì)胞，記憶型B細(xì)胞和生發(fā)中心細(xì)胞則相對(duì)正常組織有所減少。
在對(duì)基質(zhì)細(xì)胞亞群的分析中，研究人員發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞亞群在正常組織到癌組織的轉(zhuǎn)化中也有很大變化。
首先，研究人員發(fā)現(xiàn)了一群CRC中特有的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），而且這些CAFs的染色質(zhì)可及性是由轉(zhuǎn)錄因子RUNX1特異性調(diào)控的。
其次，通過(guò)對(duì)scATAC-seq數(shù)據(jù)的聚集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了另一群在息肉和CRC中都富集的成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞的染色質(zhì)可及性與CAFs有部分相似（例如WNT2基因區(qū)域），因此研究人員將這群成纖維細(xì)胞定義為癌前相關(guān)成纖維細(xì)胞（preCAFs）。研究人員推斷這些preCAFs可能與CAFs有相似的功能，并可能促進(jìn)癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化。
研究人員還在息肉和癌組織中觀察到很多具有干細(xì)胞特性的上皮細(xì)胞，而且這些干細(xì)胞樣細(xì)胞的豐度隨著惡性轉(zhuǎn)化而上升。
基于snRNA-seq和scATAC-seq建立的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換軌跡，研究人員發(fā)現(xiàn)在正常組織→息肉→CRC的惡性轉(zhuǎn)化中，干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞的基因表達(dá)和染色體可及性都呈遞進(jìn)式變化。與之相反，分化成熟的腸細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化中則減少，其中杯狀細(xì)胞的減少尤為明顯。
因此，研究人員推斷這群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞可能代表了癌癥干細(xì)胞，而杯狀細(xì)胞的缺失或許也會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
除此之外，研究人員通過(guò)表觀遺傳組學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，在正常組織→息肉→癌組織的轉(zhuǎn)化中，染色體發(fā)生有序的打開(kāi)和關(guān)閉，同時(shí)癌癥相關(guān)基因也發(fā)生有序的上調(diào)或下調(diào)。在不同的階段，調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子的活性和特異性也有所不同。
在轉(zhuǎn)化早期，具有轉(zhuǎn)錄因子TCF和LEF結(jié)合基序的染色質(zhì)區(qū)域的可及性上調(diào)，由此可以推斷WNT通路也逐漸上調(diào)。與此同時(shí)，調(diào)控腸干細(xì)胞命運(yùn)的主要基因ASCL2的基序結(jié)合區(qū)域的染色體可及性，在息肉和CRC中也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。這與研究人員觀察到的干細(xì)胞樣細(xì)胞群體的擴(kuò)大相符。
具有轉(zhuǎn)錄因子HNF4A結(jié)合基序的染色質(zhì)區(qū)域的可及性則表現(xiàn)出更高的波動(dòng)性，這一區(qū)域的活性在轉(zhuǎn)化早期降低，而在惡性轉(zhuǎn)化階段升高。研究人員由此推斷HNF4A在息肉和CRC中可能有不同的功能。在息肉中，HNF4A活性的降低或許使WNT通路得以被激活，而在CRC中，HNF4A可能通過(guò)驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)可及性變化來(lái)調(diào)控癌癥特異基因的表達(dá)。
最后，研究人員還觀察到，息肉中的染色質(zhì)可及性程度和CRC中的DNA甲基化程度呈高度負(fù)相關(guān)。DNA甲基化異常是導(dǎo)致CRC發(fā)生的一個(gè)重要因素。因此，研究人員建議，可以利用該負(fù)相關(guān)性檢測(cè)癌前病變，來(lái)找出具有惡化潛質(zhì)的息肉組織并進(jìn)行移除，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生的目的。
總的來(lái)說(shuō)，這個(gè)研究在單細(xì)胞層面揭示了在CRC惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中染色質(zhì)可及性，基因表達(dá)，DNA甲基化以及組織中細(xì)胞組分的變化。
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