近二十年，隨著免疫檢查點的不斷挖掘，腫瘤免疫的研究突飛猛進，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞能表達PD-L1，與T細胞的PD-1結合，激活免疫抑制信號，從而逃逸腫瘤免疫。目前，靶向腫瘤細胞的PD-L1抑制劑，已經(jīng)是行之成效的腫瘤治療策略。
然而，當前PD-L1的靶向治療存在個體反應差異大和耐藥等缺點，導致現(xiàn)有的PD-L1抑制劑療效差強人意[1]。因此，深入研究PD-L1的表達調控機制，對于增強PD-L1阻斷療效、抑制腫瘤細胞免疫逃逸至關重要。
有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞PD-L1的表達與NF-κB的過度激活密切相關[2]。在經(jīng)典的信號通路中，NF-κB蛋白被IκBα蛋白結合而受到抑制，在IκBα經(jīng)磷酸化和泛素化被蛋白酶體降解后，NF-κB得以釋放并轉運入細胞核，誘導PD-L1等靶基因表達。
腫瘤細胞在富含營養(yǎng)的微環(huán)境中生長，其增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為受到營養(yǎng)物質調控。但是腫瘤微環(huán)境中的營養(yǎng)物質，特別是葡萄糖，是否會影響腫瘤細胞免疫逃逸，目前尚有待深入研究。
近日，浙江大學呂志民課題組發(fā)現(xiàn)，葡萄糖能誘導腫瘤細胞上調PD-L1表達。具體來說，糖酵解的關鍵酶HK2磷酸化IκBα，促進IκBα降解，從而激活NF-κB通路，進而促進PD-L1表達和腫瘤免疫逃逸。相關論文發(fā)表于頂級期刊Cell Metabolism上[3]。
論文首頁截圖
首先，研究人員使用葡萄糖處理膠質母細胞瘤等多種腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)無論是低氧還是常氧條件，PD-L1的表達都隨葡萄糖濃度的提高而增加，而轉錄抑制劑能抵消葡萄糖的促PD-L1表達作用，這表明葡萄糖經(jīng)糖酵解在轉錄水平對腫瘤細胞表達PD-L1進行了調節(jié)。
HK2位于線粒體外膜，是葡萄糖進行糖酵解的第一個限速酶，把葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖（G6P）[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織糖酵解活躍，HK2過表達[5]。研究人員敲除了腫瘤細胞的HK2，發(fā)現(xiàn)即使給予葡萄糖或G6P刺激，PD-L1表達依舊減少，表明HK2是葡萄糖誘導PD-L1表達的關鍵。
研究人員對HK2介導PD-L1表達的機制進行了探究。
之前的研究表明，HK2的產(chǎn)物G6P能解救HK2從線粒體釋放至細胞質[6]，免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)HK2在細胞質中與IκBα結合，其結合被G6P促進，提示除糖酵解作用外，HK2還通過其他方式調控腫瘤細胞，而這種調控受到糖酵解影響。
既然HK2能磷酸化葡萄糖，那是否對IκBα也有激酶活性？
激酶實驗發(fā)現(xiàn)HK2在T291位點磷酸化IκBα，葡萄糖和G6P能提高其磷酸化作用，表明糖酵解不僅促進HK2結合IκBα，還促進HK2磷酸化IκBα T291。
然而，與IκBα在T291位點磷酸化水平相反的是，腫瘤細胞經(jīng)葡萄糖刺激后，IκBα表達竟然降低。這提示HK2介導的IκBα磷酸化負性調節(jié)了IκBα的表達，進一步的實驗證實IκBα T291被HK2磷酸化后在蛋白層面促進了IκBα降解。
那么，IκBα蛋白在磷酸化后又是通過何種方式被降解的呢？
除經(jīng)典的由IKK激酶介導的磷酸化后泛素-蛋白酶體降解途徑外[7]，IκBα還能與蛋白酶μ-calpain結合并被降解[8]。研究人員對這兩種方式分別進行了檢測。
IKK磷酸化IκBα的位點在S32和S36，不在T291，而且T291突變不改變IκBα泛素化水平，提示HK2促進IκBα降解的機制不是泛素-蛋白酶體；蛋白結合實驗發(fā)現(xiàn)IκBα T291磷酸化后與μ-calpain的結合增多，抑制μ-calpain能提高T291磷酸化的IκBα蛋白含量。這些結果表明，IκBα經(jīng)HK2磷酸化后與μ-calpain結合被降解。
IκBα是NF-κB信號通路的抑制蛋白，IκBα的降解意味著NF-κB信號的激活。研究人員對腫瘤細胞的NF-κB和PD-L1進行了檢測，發(fā)現(xiàn)過表達HK2，IκBα蛋白減少，NF-kB入核增多，PD-L1表達上調。糖酵解通過HK2磷酸化IκBα促進降解，激活NF-κB上調PD-L1表達。
HK2經(jīng)G6P協(xié)助脫離線粒體后結合并磷酸化IκBα促進其降解，激活NF-κB上調PD-L1表達
接著，研究人員在體外檢測了腫瘤細胞HK2/IκBα對T細胞的影響。他們將CD8+T細胞和腫瘤細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞的HK2離開線粒體磷酸化IκBα后，CD8+T細胞γ干擾素產(chǎn)生減少，而在腫瘤細胞IκBα T291位點突變喪失磷酸化后，CD8+T細胞γ干擾素的生成抑制被解除。這說明HK2介導的IκBα T291磷酸化能抑制CD8+T細胞活化。
然后，研究人員在體內(nèi)驗證了HK2/IκBα在腫瘤發(fā)生和免疫逃逸中的作用。腦膠質瘤小鼠在HK2過表達后腫瘤更大，生存期更短，HK2和IκBα的結合增多，IκBα T291磷酸化上調，IκBα蛋白水平降低，PD-L1表達增加，CD8+T細胞浸潤減少。
而在IκBα T291位點突變后，腦膠質瘤小鼠的腫瘤縮小，生存期延長，PD-L1水平降低，CD8+T細胞浸潤和顆粒酶B表達增加。這些結果表明，HK2介導的IκBα T291磷酸化，減少了CD8+T細胞在腫瘤中的浸潤和激活，以及隨后的腫瘤免疫逃避。
最后，研究人員在腦膠質瘤中對靶向HK2的治療進行了探索。他們發(fā)現(xiàn)HK2抑制劑和抗PD-1抗體聯(lián)用，比單藥更能抑制小鼠腫瘤生長，延長生存期，強烈抑制HK2介導的IκBα T291磷酸化和PD-1表達，顯著提高CD8+T細胞在瘤體內(nèi)的浸潤和顆粒酶B表達，提示聯(lián)合HK2抑制劑和免疫檢查點阻斷的療法能消除腫瘤免疫逃避。
HK2過表達的腦膠質瘤小鼠腫瘤更大，生存期更短
此外，研究人員還通過自收樣本并結合線上數(shù)據(jù)庫，對HK2調控PD-L1表達的臨床意義進行了驗證。在腦膠質細胞瘤中，HK2 mRNA水平與IκBα T291磷酸化水平和PD-L1 mRNA表達呈正相關，與CD8+T細胞浸潤和生存期呈負相關。
總的來說，這項研究以糖代謝為突破點，發(fā)現(xiàn)了糖酵解限速酶HK2能上調腫瘤細胞PD-L1表達，闡明了葡萄糖通過HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1信號通路促進腫瘤免疫逃逸的機制，并在動物模型中證明了抑制HK2能增強CD8+T細胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤和活化，提高免疫治療療效，改善預后。
葡萄糖通過HK2/IκBα/NF-κB/PD-L1促進腫瘤免疫逃逸機制示意圖
HK2不僅能作為糖代謝酶參與糖酵解，還能作為蛋白激酶參與腫瘤免疫逃逸。這為遏制腫瘤免疫逃逸，提高免疫檢查點抑制劑療效提供了新的靶點和思路。
參考文獻
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