在多細胞生物中，不同類型的細胞在組織內(nèi)會以特殊的模式組織起來。在顯微鏡下觀察，這些形形色色的細胞可能因為占據(jù)了獨特的位置、表現(xiàn)為不尋常的形狀或表達特定的生物標(biāo)志物分子而千姿百態(tài)。當(dāng)然，這些細胞之間還存在著更深層意義的差別，即基因表達的差別。研究人員通過轉(zhuǎn)錄組測序，即對細胞內(nèi)存在的多種RNA分子進行測序，來更深入地了解細胞的類型和基因表達模式。
基因表達具有時間特異性和空間特異性，即不同的組織或細胞在特定發(fā)育階段或功能狀態(tài)下，基因表達會存在變化，比如胚胎發(fā)育過程中生物分子水平存在飛快的動態(tài)變化，同時細胞之間的空間關(guān)系導(dǎo)致了子細胞之間對稱性的破壞、決定了細胞未來的命運。通過在不同時間點使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進行采樣，能夠了解某一細胞或組織基因表達的時間特異性。而空間特異性信息則相對較難獲得，原因是常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在還原細胞所處的原始位置信息上存在困難，而傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)（In Situ Hybridization，ISH）又很難實現(xiàn)高通量檢測，一次最多只能分析少數(shù)幾個基因。為此，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)運而生。
2021年8月11日，美國的研究團隊在Nature發(fā)表回顧常見空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的綜述文章“Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics”[1]，將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分為兩大類：（1）基于新一代測序（Next-Generation Sequencing，NGS）的方法，即在NGS前將位置信息編碼到轉(zhuǎn)錄本上；（2）基于成像的方法，該方法又分為基于原位測序（In Situ Sequencing，ISS）的方法——直接在組織中對轉(zhuǎn)錄本進行擴增和測序，以及基于ISH的方法——成像探針在組織中被依次雜交（圖1）。這些方法雖然不同，但最終都可以看作是構(gòu)建了一個基因表達矩陣，該矩陣對每個點（一個像素、一個細胞或一組細胞）的轉(zhuǎn)錄組進行捕獲。
不過，現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)依然存在一些限制，比如：僅能捕獲細胞總RNA分子的一小部分；達不到單細胞測序方法所能提供的分析深度和質(zhì)量；破壞了原始細胞組織的環(huán)境使得對樣本進行后續(xù)分析變得不可能；以及需要專門的儀器或試劑導(dǎo)致成本高昂。這些缺陷阻礙了對不連續(xù)的細胞群或罕見且難以分離的細胞（比如某些特殊的腦細胞，或侵入腫瘤的免疫細胞）的研究。
為此，哈佛大學(xué)Wyss仿生工程研究所的團隊開發(fā)了一項名為“Light-Seq”的DNA納米驅(qū)動技術(shù)。研究成果以“Light-Seq: light-directed in situ barcoding of biomolecules in fixed cells and tissues for spatially indexed sequencing”為題于2022年10月10日發(fā)表于Nature Methods（圖2）[2]。
圖2 研究成果（圖源：[2]）
該技術(shù)允許研究人員通過光交聯(lián)過程選擇特定的目標(biāo)細胞，然后利用DNA標(biāo)簽（barcode）對目標(biāo)細胞全部的RNA序列進行“地理標(biāo)記”，隨后在DNA驅(qū)動技術(shù)的幫助下，翻譯成DNA單鏈以進行NGS測序。對于同一樣本中的不同細胞群體，可以使用不同的DNA標(biāo)簽重復(fù)Light-Seq過程，以便后續(xù)分析（圖3）。
圖3 Light-Seq的概覽（圖源：[2]）
Light-Seq項目由Jocelyn（Josie）Kishi博士、Sinem Saka博士和Ninning Liu博士以及Emma West博士牽頭。2019年，Kish、Saka和West共同開發(fā)了一種名為SABER-FISH的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，該方法用于直接在完整組織中對基因表達進行成像，能夠在固定的細胞和組織中將RNA和DNA FISH信號放大5到450倍。盡管如此，“距離捕捉細胞完整的基因表達程序還有好幾個數(shù)量級的差距。每個細胞有數(shù)千個不同的RNA分子，RNA分子過于密集，無法用目前的成像技術(shù)完整捕獲?！盞ishi說，“而Light-Seq借助更高分辨率的DNA標(biāo)簽和NGS全轉(zhuǎn)錄組測序，兩全其美地解決了這個問題?！?/p>
首先，DNA引物與細胞中的RNA分子進行堿基配對，以RNA為模板擴建出RNA的副本，即互補DNA（complementary DNA，cDNA）。然后，通過紫外光的照射，將含有超快光交聯(lián)劑的標(biāo)簽DNA通過光交聯(lián)反應(yīng)“粘到”目標(biāo)區(qū)域的cDNA上，而未被紫外光照射的區(qū)域，標(biāo)簽DNA會在之后的步驟中被洗脫，這樣就對感興趣的區(qū)域打上了標(biāo)記。若是使用不同的標(biāo)簽配合照射不同區(qū)域的紫外光重復(fù)該過程，則能標(biāo)記更多的區(qū)域。
圖4 DNA光刻進行空間尋址標(biāo)記（圖源：[2]）
圖5 拼接反應(yīng)與Light-Seq的工作流程（圖源：[2]）
為了驗證該技術(shù)的細胞選擇能力和“貼標(biāo)簽”的能力，研究人員將小鼠3T3細胞和穩(wěn)定表達eGFP的人類HEK細胞混合進行測試?；趀GFP表達和細胞形態(tài)信息，研究人員對細胞進行了手動選擇并標(biāo)記以不同的“標(biāo)簽”。結(jié)果表明，小鼠和人類圖譜對于其各自的“標(biāo)簽”具有良好的區(qū)分率，尤其是eGFP reads歸類到人類“標(biāo)簽”的正確率高達93±0.5%。序列提取后，又對樣本進行了多重免疫熒光，驗證了樣本具備進行二次分析的完整性。
在培養(yǎng)細胞中首次驗證Light-Seq之后，研究人員希望將其應(yīng)用于更復(fù)雜的組織，因為組織樣本中特定細胞群的RNA測序仍然充滿挑戰(zhàn)性，尤其是當(dāng)靶細胞很少或難以分離時。為此，Kishi，Saka，Liu和West聯(lián)手，將Light-Seq應(yīng)用于小鼠的視網(wǎng)膜切片。研究人員手動劃分了視網(wǎng)膜經(jīng)典具備不用功能的三個細胞層。結(jié)果表明，Light-Seq達到了與單細胞測序方法相當(dāng)?shù)男蛄懈采w率，并發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜的三個主要層之間富集了數(shù)千個RNA（圖6）。此外，樣本保持了完整，仍能進一步對蛋白質(zhì)和其他生物分子進行成像。
圖6 Light Seq應(yīng)用于小鼠視網(wǎng)膜切片（圖源：[2]）
將Light-Seq發(fā)揮到極致，研究人員分離出了一種非常罕見的細胞類型的完整轉(zhuǎn)錄組，這種細胞與視網(wǎng)膜內(nèi)的其他細胞聯(lián)系極其復(fù)雜，因此難以分離?！癓ight-Seq還提取了該細胞中表達水平極低的特異性RNA，以及據(jù)我們所知前人從未描述過的數(shù)十種特異性生物標(biāo)志物RNA，這為研究這種罕見細胞類型開辟了新的機會?！盬est說。
將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域向NGS敞開還帶來了有關(guān)單個RNA種類水平的信息。Kishi表示：“Light-Seq可以確定RNA結(jié)構(gòu)的自然變異?！闭雇磥恚琄ishi對Light-Seq應(yīng)用于更好地了解免疫系統(tǒng)、疾病傳播細胞以及基因和細胞治療等不同治療策略之間的相互作用充滿興趣，現(xiàn)在，她正積極地與合作者們一起尋求將Light-Seq商業(yè)化的道路。
