來源：生輝 2023-08-28 14:30
目前，其已證明：雙信號的整合可以增強納米通道的能力，從而能讓納米通道根據(jù)半胱氨酸基團的暴露程度，來區(qū)分蛋白質的折疊狀態(tài)，進而可以促進基于蛋白質構象的疾病診斷的發(fā)展。
“記得小時候偶然看到父親在實驗室做焰色反應實驗，那絢麗的顏色深深刻在我的腦海里。這是我對化學的初印象，也是引導我走上科研道路的契機?！敝袊刭|大學（武漢）婁筱叮教授說。
▲圖 | 婁筱叮（來源：資料圖）
作為一名教師兼科研人員，婁筱叮是另一種版本的“長大后我就成了你”。父親是老師，她也是老師；父親愛化學，她也愛化學。
其表示：“在很多人眼中化學研究是枯燥乏味的，不少人打心底害怕做科研。其實這都是刻板印象，現(xiàn)在的科研條件比以前好太多，科研工作也給了我更多獨立思考的空間，以及可以探索未知的快樂?！?/p>
前不久，婁筱叮聯(lián)合同校的夏帆教授利用納米通道外表面的潤濕性變化，成功檢測了腫瘤標志物“基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）”。
通過調節(jié)兩親性肽之中苯丙氨酸的數(shù)量，可以調節(jié)外表面的疏水性，從而改變離子電流的變化比，進而可以降低檢測限的數(shù)值大小。
（來源：ACS Nano）
實驗結果顯示，本次檢測系統(tǒng)能夠檢測細胞分泌的 MMP-2?；谶@一系統(tǒng)該團隊證明 MMP-2 的表達與細胞周期存在相關性，并且在細胞 G1/S 期處于最高水平。
此前，人們主要研究納米通道外表面，對于它的潤濕性學界普遍較少關注。而該成果全面、系統(tǒng)地闡述了潤濕性的作用和機制，并排除了其他因素的影響。
研究中，他們選擇多種腫瘤細胞過量表達的基質金屬蛋白酶作為主要研究對象。這種酶的底物是多肽序列，能夠被特異性地切割。
隨后，基于納米通道檢測系統(tǒng)的浸潤性變化，可以對這種酶進行檢測。
一開始，納米通道外表面探針在設計上，并不具有明顯的普適性。當該團隊更換三個單元中的酶響應序列時，就能對檢測不同的蛋白酶，比如弗林蛋白酶、凋亡蛋白酶、組織蛋白酶等。
蛋白酶的異常表達與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此本次納米通道系統(tǒng)有望作為一款便攜通用的腫瘤或疾病標志物檢測策略來輔助臨床診斷。
目前，課題組已經(jīng)嘗試開展產業(yè)孵化，例如其正在打造基于納米孔道芯片的前列腺癌早期篩查設備。
進一步地，他們打算將該團隊的表面定向偶聯(lián)技術搭載到上述產品之上。這樣一來對于那些與疾病相關的蛋白來說，就能精準地獲取它們的動態(tài)變化信息。
成功檢測腫瘤標志物“基質金屬蛋白酶-2”
據(jù)介紹，此前以細胞膜上的通道蛋白為啟發(fā)，學界研發(fā)了固態(tài)仿生納米通道。其具備較高的機械強度、多樣化的修飾手段、孔隙尺寸可被調節(jié)等優(yōu)勢。
經(jīng)過特定捕獲探針的修飾，以及生物靶標與捕獲探針的相互作用，納米通道的尺寸、電位、疏水性等微小變化，都有可能讓離子電流出現(xiàn)明顯變化，從而可以分析多種尺度的生物靶標。
而在這些生物靶標中，包括納米級的離子、小分子、核酸、蛋白質到微米級的細胞。
然而，目前基于納米通道的檢測系統(tǒng)，大多都是基于納米通道內壁來做修飾探針。這意味著生物靶標必須進入納米通道，以確保與探針的相互作用。
當以蛋白質作為靶標時，由于納米通道內部是一個封閉空間，因此尺寸較大的蛋白質很難到達探針的識別位置，從而導致檢測效率偏低。
而且，在這種情況下要想實現(xiàn)生物靶標尺寸和孔徑的完美適配性，往往要面對重現(xiàn)性較差的問題。那么，能否利用納米孔的外表面來實現(xiàn)檢測？
此前，婁筱叮和夏帆曾嘗試區(qū)分納米通道的內表面和外表面，并通過區(qū)域化修飾揭示了不同表面的角色。
例如，通過監(jiān)控納米通道外表面的表面電荷的變化，可以用來檢測各種生物靶標。
考慮到固態(tài)表面電荷儀器的稀有性，以及電荷測量容易受到多種因素的影響，該團隊提出了上述新策略：即利用納米通道外表面浸潤性的變化，來檢測“基質金屬蛋白酶-2”這一腫瘤標志物。
具體來說，他們選擇了一種多肽材料，其具有可編輯性、生物活性和多樣性等優(yōu)勢。其將這種多肽材料作為外表面的修飾探針，從而形成基于多肽的外表面探針。
這種探針由三個單元組成：半胱氨酸組成的親水單元、MMP-2 響應識別單元、以及由多個苯丙氨酸組成的疏水單元。
當與 MMP-2 作用之后，由于疏水單元的離開，納米通道外表面的親水性開始增加，進而讓離子電流出現(xiàn)增加。
此外，疏水單元的數(shù)量也得到了精準調節(jié)，從而讓 MMP-2 的檢測靈敏度得以提高。這讓納米通道能夠成功檢測到細胞分泌的 MMP-2，并發(fā)現(xiàn) MMP-2 的分泌與細胞周期有關。假如在細胞 G1/S 期進行檢測，還可以獲得更高的準確性。
而在此前，只有當納米通道的內外表面不作區(qū)分時，浸潤性才能起到協(xié)同作用。而該課題組證實納米通道外表面的浸潤性變化，可以影響它的離子電流。
由此可見，調節(jié)納米通道外表面的浸潤性，對于標志物檢測以及了解納米通道的作用機制具有重要意義。
收獲時間的復利
據(jù)介紹，近年來該課題組始終圍繞納米通道外表面在檢測方面的應用和機理開展研究。當他們確定電荷的作用之后，便開始定下調控浸潤性的目標。
為了讓浸潤性發(fā)生更大的變化，他們開始引入超分子結構。但在這時調控性能開始變差，這樣一來就無法排除尺寸效應和電荷效應的影響，也就無法確定浸潤性在電流變化中扮演的角色。
經(jīng)過討論之后該團隊打算去繁化簡，讓序列中只剩下多肽。多肽，由一個個的氨基酸串聯(lián)而成。
而對于氨基酸的性質此前已有不少研究，人們發(fā)現(xiàn)對氨基酸數(shù)量進行增減之后，就能實現(xiàn)多肽探針性質的精細調控。
利用上述方法，該課題組獲得了較為理想的初步效果。隨后，他們用實驗來驗證浸潤性在這種體系里的作用，并將其用于檢測生物系統(tǒng)中蛋白酶，借此發(fā)現(xiàn)了 MMP-2 酶與周期的關系。
期間，他們曾多次嘗試使用具備多肽功能的納米孔道，來監(jiān)測活細胞的 MMP-2 酶，但卻一直未能取得理想結果。
婁筱叮表示：“當面對困境我們該如何破局？這時我想到一句話：積力所舉，則無不勝；眾智所為，則無不成?；蛟S團隊之力，可以讓課題迸發(fā)出新的生機?！?/p>
于是，她緊急召開一次團隊會議。會上，她鼓勵大家坦誠交流，共同審視實驗步驟。最終，他們成功制定出新的實驗方案，并獲得令人滿意的實驗數(shù)據(jù)。
而在剛開始進行蛋白質孔道的工作時，有三大難關擺在他們面前：蛋白質如何誘導純化？磷脂雙分子層如何構建？蛋白質孔道結構如何搭建？
盡管已經(jīng)做好要過五關斬六將的準備，但在實操之中依然遇到了意料之外的難題。
在其中一次實驗里，他們需要以“50-150μm”的小孔作為載體，用毛筆刷出容易被蛋白插入的磷脂雙分子層，整個過程如“引針穿線”一般，需要精細的手法和十足的耐心。
最終，相關論文以《酶對納米通道外表面潤濕性的調控》（Enzyme Regulating the Wettability of the Outer Surface of Nanochannels）為題發(fā)在 ACS Nano，HuJingJing 是第一作者，婁筱叮和夏帆擔任共同通訊作者。 ▲圖 | 相關論文（來源：ACS Nano） 婁筱叮繼續(xù)說道：“我還要特別感謝夏帆教授對這項工作的指導。”據(jù)介紹，她與夏帆的合作始于 2013 年。 當時，他們將有機分子與納米孔道相結合，設計并合成了一系列熒光探針，這些探針主要基于小分子、核酸和多肽。同時，他們還打造了與功能納米孔道相結合的生物傳感器。 在熒光探針和生物傳感器的幫助之下，他們針對生命復雜體系、動物器官、人體尿液以及病人組織樣本中的靶標分子實現(xiàn)了直接檢測。 在本次工作之外，其又聚焦于“空間限域”孔道內表面和外表面的離子調控，闡明了限域空間之下的物質傳輸新機制，借此構筑一種新的界面，這種界面具備可被精準功能化、以及可被表征的特點。 未來，該團隊將繼續(xù)致力于納米孔道的研究，將蛋白孔道異質化用于蛋白質測序中。具體來說： 其一，他們將繼續(xù)針對固體納米通道外表面打造定向修飾的探針，通過電信號和光信號，來對蛋白質的折疊/解折疊狀態(tài)進行動態(tài)分析。 目前，其已證明：雙信號的整合可以增強納米通道的能力，從而能讓納米通道根據(jù)半胱氨酸基團的暴露程度，來區(qū)分蛋白質的折疊狀態(tài)，進而可以促進基于蛋白質構象的疾病診斷的發(fā)展。 其二，他們仍將深耕于蛋白納米孔道的異質化工作。通過蛋白質工程來對蛋白納米孔道的外表面和內腔，進行單位點的精細化改造，以期提高現(xiàn)有納米孔道傳感界面的空間分辨能力，從而實現(xiàn)不同分析物的精準區(qū)分，最終在蛋白質單分子測序上取得突破。
