北京大學生命科學學院李龍研究員課題組在Nature Structural & Molecular Biology雜志發(fā)表題為“Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex”的論文。該研究報道了線粒體中介導蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的TOM-TIM23超級復合體的結(jié)構(gòu)和生化結(jié)果，揭示了蛋白質(zhì)通過TOM復合物跨越線粒體外膜的新途徑，并重新定義了線粒體內(nèi)膜TIM23轉(zhuǎn)運體復合物的核心組成。
線粒體作為真核細胞中最重要的細胞器之一，在能量供應、胞內(nèi)代謝、體內(nèi)平衡和細胞凋亡等過程中都扮演重要的角色。線粒體具有獨特的內(nèi)外雙層脂膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部分布著超過1000種蛋白質(zhì)。99%的線粒體蛋白質(zhì)都是由細胞核基因編碼，在細胞質(zhì)的核糖體中合成，并跨膜轉(zhuǎn)運至線粒體中發(fā)揮功能。因此，線粒體蛋白質(zhì)的運輸對于維持和調(diào)控線粒體的活性至關(guān)重要，相關(guān)基因的突變與人類許多代謝疾病和癌癥的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)。李龍課題組一直致力于探究線粒體蛋白質(zhì)進入線粒體的分子機制，已經(jīng)發(fā)表的工作包括解析線粒體膜蛋白通過TIM22轉(zhuǎn)運復合物進入內(nèi)膜的途徑（Zhang Y. et al Cell Research 2021）。此次研究的TOM-TIM23超級復合物在線粒體蛋白轉(zhuǎn)運中的作用更為重要。這個超級復合物由數(shù)十種蛋白亞基組裝而成，跨越線粒體內(nèi)外雙層膜，控制超過500種線粒體可溶蛋白和膜蛋白的運輸。在過去的40年里，研究人員對TOM和TIM23轉(zhuǎn)運復合物的各個亞基進行了廣泛而深入的研究。然而，由于該超級復合物的高度動態(tài)性，人們對于這些亞基如何組裝形成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運通路這一核心問題的了解仍然非常有限，尤其是內(nèi)膜中的TIM23復合物，其核心轉(zhuǎn)運單元的組成一直很不明確。
在此項研究中，作者首先從組裝穩(wěn)定的TOM-TIM23超級復合物入手，探索多種組裝方案，最終選擇將綠色熒光蛋白與線粒體蛋白質(zhì)融合作為轉(zhuǎn)運底物，在酵母細胞內(nèi)捕獲了TOM-TIM23超級復合物轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)底物的中間狀態(tài)。經(jīng)過體外提純，這種中間態(tài)仍然可以穩(wěn)定存在，用于進一步的結(jié)構(gòu)生物學和生物化學研究。通過冷凍電子顯微鏡單顆粒分析該中間態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)位于外膜的TOM復合物和位于內(nèi)膜的TIM23復合物存在直接相互作用，將線粒體內(nèi)外膜連接起來，從而高效地將蛋白質(zhì)底物從線粒體外膜向內(nèi)膜傳遞（圖1a）。其中，TOM復合物的分辨率解析到了4.1?，該結(jié)構(gòu)揭示了一條位于Tom40通道亞基內(nèi)壁、在各個物種中都很保守的“極性氨基酸路徑”，該路徑介導蛋白質(zhì)底物以非折疊的形式通過Tom40的中間孔道（圖1b）。這條路徑與之前基于生化實驗提出的Tom40中的兩條跨膜路徑均不相同，顯示出TOM復合物在高效識別和轉(zhuǎn)運各種線粒體蛋白質(zhì)過程中的多能性。
圖1. TOM-TIM23超級復合物的結(jié)構(gòu)。(a)TOM-TIM23超級復合物的組裝示意圖和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。(b)包含蛋白質(zhì)底物的TOM復合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)模型。(c) Tim17-Tim23-Mgr2異源三聚體的AlphaFold2結(jié)構(gòu)模型
此外，作者在蛋白質(zhì)底物的不同位點系統(tǒng)性地引入非天然氨基酸，利用光交聯(lián)技術(shù)探測了TOM-TIM23的轉(zhuǎn)運通路中蛋白質(zhì)底物的周圍環(huán)境，從而鑒定出直接幫助底物跨越兩層脂膜的核心亞基。實驗結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)底物的C端片段可以與外膜的Tom40亞基交聯(lián)，這一結(jié)果與結(jié)構(gòu)觀測相符。然而，令人意外的是，蛋白質(zhì)底物的N端片段在內(nèi)膜中與Tim17和Mgr2兩個亞基交聯(lián)，而不與普遍認定的構(gòu)成內(nèi)膜轉(zhuǎn)運通道的Tim23亞基交聯(lián)。這一結(jié)果表明，在過去的研究中，對TIM23復合物核心轉(zhuǎn)運通路的認知可能存在重大偏差。為了進一步確定TIM23中的核心轉(zhuǎn)運亞基及通路，作者綜合利用AlphaFold2建模、生化交聯(lián)、酵母遺傳學和線粒體蛋白質(zhì)體外轉(zhuǎn)運等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TIM23復合物的核心成分是一個由Tim23、Tim17和Mgr2亞基組成的異源三聚體，其中Tim17和Mgr2面對面形成一個通道狀結(jié)構(gòu)，而Tim23以背靠背的形式與Tim17結(jié)合，不參與通道的形成（圖1c）。在蛋白轉(zhuǎn)運的過程中，蛋白質(zhì)底物穿過Tim17和Mgr2形成的通道狀結(jié)構(gòu)，不直接與Tim23亞基接觸。突變實驗發(fā)現(xiàn)，在酵母中敲除Mgr2并不影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，說明在Tim17和Mgr2組成的通道狀結(jié)構(gòu)中，只有Tim17是必需的。Tim17之所以可以幫助蛋白質(zhì)穿過內(nèi)膜是由于其獨特的表面氨基酸分布：一方面，Tim17在內(nèi)膜入口處有一個高度保守的負電區(qū)域，可以破壞局部磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，降低蛋白質(zhì)穿過脂膜的能量勢壘；另一方面，在通路的中心，Tim17有一個保守的疏水區(qū)域，有助于線粒體內(nèi)膜保持密閉狀態(tài)，維持線粒體各項生理活動所需的膜電勢。綜合各項結(jié)構(gòu)和生化實驗結(jié)果，可以認定TIM23復合物以Tim17亞基為核心，采取混合模式幫助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，即Tim17可以與其他亞基動態(tài)結(jié)合形成幫助蛋白質(zhì)跨膜的通道，或者Tim17以插入酶的工作模式單獨完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，不需要通道的形成。這一結(jié)果更正了過去40年領(lǐng)域內(nèi)認為Tim23亞基構(gòu)成核心通道的錯誤認知。
綜上所述，這項研究開發(fā)了一套新穎的蛋白轉(zhuǎn)運研究策略，揭示了線粒體蛋白質(zhì)通過TOM-TIM23超級復合物穿越雙層脂膜的關(guān)鍵路徑（圖2），顛覆了長期以來領(lǐng)域里對內(nèi)膜TIM23轉(zhuǎn)運復合物的核心組分的認知，發(fā)現(xiàn)了全新的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運酶工作模式，為全面深入理解線粒體的生物合成奠定了堅實基礎(chǔ)。
圖2. 線粒體TOM-TIM23轉(zhuǎn)運通路
李龍為該論文通訊作者，北大-清華生命科學聯(lián)合中心2018級博士生周雪垠、生命科學學院2019級博士生楊玉琪、北京大學冷凍電鏡平臺王國鵬博士和生命科學學院2020級博士生王珊珊為共同第一作者。李龍實驗室前技術(shù)員孫東杰，生命科學學院2022級博士生歐曉敏、2021級博士生連宇珂為該研究工作作出重要貢獻。北京大學生命科學學院高寧教授和李寧寧副研究員、中國科學院生物物理研究所章新政研究員在冷凍電鏡數(shù)據(jù)計算方面提供了極大幫助，北京大學生命科學學院李晴教授和昌增益教授分別對酵母遺傳學和光交聯(lián)實驗提供了重要指導。該研究工作得到北京大學冷凍電鏡平臺、高性能計算中心、生命科學學院儀器中心以及國家鳳凰蛋白質(zhì)平臺的大力支持，獲得膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯(lián)合中心和國家自然科學基金項目的資助。
