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如果你還處于實(shí)驗(yàn)剛?cè)腴T(mén)階段，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)就是必學(xué)技能，很多小伙伴對(duì)于這一塊的知識(shí)點(diǎn)都是“知其然而不知其所以然”，一知半解肯定是對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)研究有非常大的影響，所以今天本著授人以魚(yú)不如原則，詳細(xì)解說(shuō)每一個(gè)知識(shí)點(diǎn)，讓大家完全get！
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一、細(xì)胞增殖
1. 細(xì)胞增殖的定義
細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì) 胞，用來(lái)補(bǔ)充體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。
2. 細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法
① 細(xì)胞代謝活性檢測(cè)
（基于MTT、CCK-8等）
MTT（噻唑藍(lán)）：通過(guò)添加四咪唑鹽到細(xì)胞中可進(jìn)行線(xiàn)粒體內(nèi)酶代謝活性的測(cè)定?；罴?xì)胞能將四咪唑鹽（如MTT、XTT、WST-1）還原成藍(lán)紫色的甲瓚或甲瓚鹽（Formazan），可通過(guò)分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
Cell Counting Kit–8 （CCK-8）中的WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng) 基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比?；贑CK-8（WST-8）的試劑盒能高度準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞增殖，比MTT法 及XTT法的靈敏度高5倍，能檢測(cè)更低的細(xì)胞數(shù)目。該試劑盒可適用于96孔板培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞。
② DNA的合成的檢測(cè)
（基于BrdU的免疫法或EdU的點(diǎn)擊化學(xué)法），可通過(guò)體內(nèi)成像、微孔板或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 等多種技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞示蹤。
DNA的新組裝合成是細(xì)胞生長(zhǎng)的必要條件，故經(jīng)常被用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力及凋亡的檢測(cè)。BrdU及EdU，都是胸腺嘧啶的非放射性類(lèi)似物，能摻入增殖細(xì)胞的DNA中，可通過(guò)對(duì)BrdU及EdU的檢測(cè)，從而對(duì)DNA的合 成量進(jìn)行測(cè)定。
EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲 入正在復(fù)制的DNA分子中，通過(guò)基于EdU與Apollo?熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì) 胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。
二、細(xì)胞凋亡(apoptosis)
1. 細(xì)胞凋亡（apoptosis）的定義
細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。
特點(diǎn)：細(xì)胞皺縮、體積縮?。徊糠旨?xì)胞器、核糖體和核碎片被細(xì)胞膜包裹形成 凋亡小體，從細(xì)胞表面出芽脫 落，最后被具有吞噬功能的細(xì)胞吞噬；磷脂酰絲 氨酸外翻；細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化、染色質(zhì)DNA斷裂。
2. 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法
包括：Caspase活性檢測(cè)；DNA片段化分析和檢測(cè)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；膜變化檢測(cè)（AnnexinV染色、膜 電位、線(xiàn)粒體功能完整性分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)）及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)。
① Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液 用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。
Annexin V可與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）能夠透過(guò)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配 使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
② 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)-熒光染色法（Hoechst/DAPI）
細(xì)胞形態(tài)的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質(zhì)致密、胞質(zhì)濃縮等，都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形 態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。DNA 特異性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三種染料與 DNA 的結(jié)合都是非嵌入式的，主要結(jié)合在 DNA 的 A-T 堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
結(jié)果評(píng)判
Ⅰ 期：細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）， 部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；
Ⅱa 期：細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；
Ⅱb 期：的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體
③ TUNEL（原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（in situ end labelling technique,ISEL)）
細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈/單鏈斷裂二產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒 光素、地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì) 胞裂解后3‘-OH端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)（細(xì)胞染成棕黃色）后檢測(cè)DNA裂解點(diǎn)的技術(shù)。
三、細(xì)胞自噬（Autophagy）
1.細(xì)胞自噬的定義
自噬（Autophagy）是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種高度保守的代謝過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食（Self-eating）”現(xiàn)象。它作為細(xì)胞內(nèi)的主要降解途徑，將胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解。
它主要有三 種形式：大自噬，小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。
2、細(xì)胞自噬檢測(cè)方法
① 自噬標(biāo)志物（ LC3）檢測(cè)
自噬形成時(shí)，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可 估計(jì)自噬水平的高低。LC3 這一轉(zhuǎn)變過(guò)程可被 Western Blot 和熒光顯微鏡檢測(cè)到，現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。在哺 乳動(dòng)物中，LC3 包含 3 種亞型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的組織中，因此需要用不同的抗體去鑒定這3種亞型。
② GFP-LC3 單熒光自噬指示體系
利用 LC3 在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象構(gòu)建了 GFP-LC3 指示體系，無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成 時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通 過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。
③ mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系
mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒產(chǎn)品 mRFP 用于標(biāo)記及追蹤 LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體。 由于 GFP 熒光蛋白對(duì)酸性敏感(pH 敏感)，當(dāng)自噬體與溶酶體融合后 GFP 熒光發(fā)生淬滅,而 mRFP 相對(duì)穩(wěn)定，因此只能檢測(cè)到紅色熒光。
要點(diǎn)：細(xì)胞凋亡、自噬和壞死的區(qū)別
凋亡：細(xì)胞皺縮、體積縮??；部分細(xì)胞器、核糖體和核碎片被細(xì)胞膜包裹形成 凋亡小體，從細(xì)胞表面出芽脫落，最 后被具有吞噬功能的細(xì)胞吞噬；磷脂酰絲 氨酸外翻；細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化、染色質(zhì)DNA斷裂。
自噬：部分細(xì)胞器腫大，在細(xì)胞質(zhì)中形成包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的雙層膜囊泡結(jié)構(gòu) ，再與溶酶體結(jié)合實(shí)現(xiàn)內(nèi)容物的降解。
壞死：細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分 ，引起局部嚴(yán)重的炎癥。
四、細(xì)胞衰老（cell aging）
1. 細(xì)胞衰老的定義
細(xì)胞衰老是細(xì)胞周期調(diào)控下多基因參與的復(fù)雜的生理病理過(guò)程，是一種抑癌機(jī)制，也是生物衰老的潛在原 因之一.細(xì)胞衰老最顯著的特征是細(xì)胞在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)仍然維持代謝活性，但因阻滯于G1期，失去了對(duì)有絲 分裂原的反應(yīng)能力和合成DNA的能力，不能進(jìn)入S期.衰老細(xì)胞有著顯著的特性，衰老細(xì)胞細(xì)胞通常體積變大， 表達(dá)pH 6.0時(shí)有高酶活性的β-半乳糖苷酶。
2.細(xì)胞衰老的檢測(cè)方法
① β-半乳糖苷酶試劑盒檢測(cè)
SA-β-gal試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老。以X-Gal為底物，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)SA?β-gal在酸性條件下穩(wěn)定表達(dá)，催化底物生成藍(lán)色 產(chǎn)物，表達(dá)SA-β-gal的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)色，從而在光學(xué)顯微鏡下觀察顏色變化以分析細(xì)胞的衰老狀況。 僅對(duì)衰老細(xì)胞進(jìn)行染色，不會(huì)染色衰老前的細(xì)胞（presenescent?cells）、靜止期細(xì)胞（quiescent?cells）、永生 細(xì)胞（immortal?cells）或腫瘤細(xì)胞。
② western blot與qPCR檢測(cè)衰老相關(guān)基因(P16、P21、P53、SIRT1、PCNA)表達(dá)。
③ 流式細(xì)胞術(shù)（PI染色）檢測(cè)細(xì)胞周期變化
細(xì)胞周期（cell cycle)：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由G0/G1期、S 期、G2期和M期組成。衰老的細(xì)胞阻滯于G1期，失去了對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)能力和合成DNA的能力，不能進(jìn)入S 期。
PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與 DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出 各個(gè)期的百分含量。
流式細(xì)胞周期結(jié)果圖解讀
五、細(xì)胞遷移和侵襲
1. 細(xì)胞遷移和侵襲的定義
①侵襲：腫瘤細(xì)胞向器官表面靠攏→腫瘤細(xì)胞用偽足貼在表面與內(nèi)皮細(xì)胞粘連→腫瘤細(xì)胞用偽足從細(xì)胞的天然間隙 到達(dá)基底層→腫瘤細(xì)胞深入器官深部→形成癌巢搜索
②轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)瘤，侵入淋巴管（或血管）→腫瘤細(xì)胞在淋巴管（或血管）內(nèi)運(yùn)行→腫瘤細(xì)胞從管中出 來(lái)，再轉(zhuǎn)移到其他淋巴結(jié)（或毛細(xì)血管）中→到達(dá)其他組織或器官
2.細(xì)胞遷移和侵襲的檢測(cè)方法
① 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移
細(xì)胞劃痕是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來(lái)檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 注意事項(xiàng)：一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是在無(wú)血清或者低血清狀態(tài)下培養(yǎng)的，否則細(xì)胞增殖就不能忽略。
按照6孔板背后畫(huà)線(xiàn)的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，這就解決了前后觀察時(shí)位置不固 定的問(wèn)題。
② Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲
細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸 酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞， 應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研 究。侵襲實(shí)驗(yàn)需鋪Matrigel，而遷移實(shí)驗(yàn)不需要。
六、腫瘤血管形成
1. 腫瘤血管生成的定義
血管生成是腫瘤發(fā)生過(guò)程中新血管的形成。它是指源于已存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈的新的毛 細(xì)血管性血管的生長(zhǎng)。腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移 行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。
2.體外管形成實(shí)驗(yàn)方法
具體從以下四個(gè)步驟弄清細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法描述
1.文獻(xiàn)檢索
2.方法確認(rèn)
3.方法提取
4.方法完善
案例分析：
miR-488靶向調(diào)控FZD7基因介導(dǎo)wnt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲
1、文獻(xiàn)檢索
（關(guān)鍵詞查找文獻(xiàn)了解相關(guān)對(duì)象的檢測(cè)內(nèi)容）
miR-488靶向調(diào)控FZD7基因介導(dǎo)wnt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。
2、方法確認(rèn)
（確認(rèn)相關(guān)對(duì)象的檢測(cè)方法）
方法一： 關(guān)鍵詞搜索(于百度學(xué)術(shù))
方法二：圖片搜索(PMC和OPEN)
PMC：搜索NCBI-選擇PMC，輸入關(guān)鍵詞,看圖找方法
網(wǎng)址：https://www.NCbi.nlm.nih.gov/pmc/?term=
OPEN：輸入關(guān)鍵詞，看圖找方法
網(wǎng)址：https://openi.nlm.nih.gov
方法三： 試劑盒查找文獻(xiàn)或方法
關(guān)鍵詞搜索相關(guān)方法的試劑盒；
根據(jù)公司網(wǎng)站查找文獻(xiàn)或具體方法步驟。
3、方法提取
（中文文獻(xiàn)參考，英文文獻(xiàn)為主提取實(shí)驗(yàn)方法。）
① 中文文獻(xiàn)參考，英文文獻(xiàn)為準(zhǔn)
② 關(guān)鍵信息需明確
4、方法完善
（包括特殊方法特殊說(shuō)明； 試劑儀器需明確；分組，時(shí)間點(diǎn)，劑量不能少。）
具體說(shuō)明：
CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖通過(guò) CCK-8 試劑盒（96992-500TESTS-F ，Sigma，美國(guó)）檢測(cè) miR-488 對(duì) MKN-45胃癌細(xì)胞增殖的影響。將 MKN-45細(xì)胞接種于96孔板中， 將實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組(未處理組) 、miR-488 mimic NC ( miR-488表達(dá)對(duì)照組)和 miR-488 mimic (miR-488表達(dá)組) ， 分別于1、2、3、4d 進(jìn)行 CCK-8 檢測(cè)。 每孔中加入 10 μL CCK-8， 孵育3.5h后利用酶標(biāo)儀（Safire2，TECAN，瑞士）在 450nm處檢測(cè)光密度值[D(450)] ，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
注意事項(xiàng)：
1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象需明確
2、相關(guān)分組需明確；
3、劑量、濃度以及檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)需明確；
4、實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)需表明
5、試劑、設(shè)備需明確產(chǎn)品信息（貨號(hào)、生產(chǎn)商、地址）；
1）參考文獻(xiàn)產(chǎn)品信息
2）選擇相關(guān)試劑盒產(chǎn)品信息
3）百度搜索產(chǎn)品信息（選擇國(guó)外公司為主）
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