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夏永振

山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授，博導(dǎo)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民的生活水平得到了很大程度的改善，高嘌呤飲食消費(fèi)明顯增加。伴隨著飲食習(xí)慣的改變，高尿酸血癥的患病率明顯提升，這一病癥已成為繼高血壓、高血糖、高血脂之后中國“第四高”。其主要誘因是由于富含嘌呤的食物在人體內(nèi)不完全降解為尿酸，在組織中的積累所致。長期尿酸過高，將引發(fā)痛風(fēng)、糖尿病、腎損傷、高血壓等疾病，對(duì)人體健康帶來重大影響。

截止2021年，高尿酸血癥的患病率已經(jīng)達(dá)到13.3%，已經(jīng)成為繼糖尿病之后第二普遍的代謝性疾病。此外，高尿酸血癥患者不斷增多且呈現(xiàn)年輕化趨勢，很多年輕人紛紛中招，體內(nèi)尿酸過高導(dǎo)致的痛風(fēng)已經(jīng)成為“當(dāng)代青年的新痛點(diǎn)”。

本次工程微生物學(xué)公眾號(hào)邀請(qǐng)到夏永振教授，與讀者一起分享他最新關(guān)于工程化改造益生菌治療痛風(fēng)的研究成果和一些思考。

能否介紹一下您是怎么想到用細(xì)菌治療高尿酸血癥的構(gòu)思？

本研究的順利開展既有一些偶然性，也有一些必然因素。契機(jī)是實(shí)驗(yàn)室相繼出現(xiàn)了兩位痛風(fēng)病人，這讓我們對(duì)痛風(fēng)和高尿酸血癥以及人體嘌呤代謝的關(guān)系有了一些感性認(rèn)識(shí)；現(xiàn)在身邊的很多同事朋友，包括我博士期間都是做合成生物學(xué)研究。長期的接觸和了解，使得自己也掌握了一些合成生物學(xué)的研究策略和操作手段。這為后期實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)提供了技術(shù)保障。

從這兩位患者的求診中，了解到目前可用于臨床的藥物仍然具有局限性。非布司他、苯溴馬隆等常用藥物都有著很大的副作用，一般用于治療慢性期痛風(fēng)，并不建議用于急性期痛風(fēng)的治療。而治療急性痛風(fēng)主要療法是止痛，基本是通過食療，即降低嘌呤攝取來治療的。但這會(huì)給患者的飲食帶來很大的挑戰(zhàn)，是一個(gè)比較痛苦的過程。

通過查閱文獻(xiàn)，我們了解到體內(nèi)多余的尿酸通過腎臟和腸道排出，其中1/3尿酸的排出通過腸道完成，并能夠被腸道菌群進(jìn)一步代謝。這些早前的研究激發(fā)了我們的設(shè)想：或許可以借助合成生物學(xué)的改造，增強(qiáng)腸道益生菌的尿酸降解能力，再將其引入到腸道中，從而發(fā)揮緩解高尿酸血癥的療效。

血尿酸的1/3通過腸道排泄，并且會(huì)被腸道菌所降解

為什么選擇大腸桿菌Nissle 1917，它相對(duì)于其它益生菌有哪些優(yōu)勢？

大腸桿菌Nissle 1917 (EcN)是一株公認(rèn)的益生菌，在一個(gè)世紀(jì)前就已被用于治療炎癥性腸病和腸易激綜合征。此外，與其他的益生菌相比較，EcN菌株的分子遺傳學(xué)特征研究的比較清楚。近幾年，隨著合成生物學(xué)的不斷發(fā)展，開發(fā)可作為治療藥物的工程益生菌已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。由于EcN本身的安全特性和遺傳可塑性，它也常被用做載體構(gòu)建的工程菌，被用來治療多種疾病。近幾年的研究中，以EcN作為宿主菌株，構(gòu)建了治療苯丙酮尿癥、高氨血癥、腸胃炎以及結(jié)直腸癌等疾病的工程菌株，都取得了良好的效果。前人的經(jīng)驗(yàn)為我們的研究提供了很大的幫助。

同時(shí)，EcN菌株還被注射到血液中用于腫瘤的治療。在近幾年的研究中，通過靜脈注射，EcN能夠作為向腫瘤部位遞送抗癌藥物的載體，這也證明將一定量的EcN注射到血液中也是相對(duì)安全的。這也為我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中選擇注射EcN用于高尿酸血癥的治療提供了啟示。

在大腸桿菌中表達(dá)這條尿酸氧化途徑的最大挑戰(zhàn)是什么？

這條異源途徑的構(gòu)建主要有三部分難點(diǎn)：第一部分是現(xiàn)有的尿酸降解途徑需要氧氣，而腸道是一個(gè)厭氧的環(huán)境。但通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)腸道中的氧氣存在著不均一性：離小腸絨毛越近的地方，氧氣含量相對(duì)充足；接近腸中腔的位置則趨向無氧環(huán)境。這些較新的認(rèn)識(shí)使我們意識(shí)到，腸道中存在可以使用的氧氣，但比較有限。為了進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)菌中氧氣的供應(yīng)，我們通過過表達(dá)細(xì)菌血紅蛋白vhb基因，提高了細(xì)菌的攜氧水平；同時(shí)還過表達(dá)了大腸桿菌自身編碼的過氧化氫酶KatG。H₂O₂是尿酸降解的副產(chǎn)物，KatG可以將H₂O₂降解為O₂，O₂又可以被回收利用，用于進(jìn)一步降解尿酸。這兩種酶的引入成功實(shí)現(xiàn)了O₂的回收利用。

第二部分，異源表達(dá)時(shí)，我們嘗試了不同的質(zhì)粒骨架以及啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)過高拷貝的質(zhì)粒以及強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)對(duì)菌株的代謝負(fù)擔(dān)加重，嚴(yán)重影響菌株的生長；使用低拷貝質(zhì)粒時(shí)，菌株的尿酸降解速率無法達(dá)到預(yù)期。在此我們嘗試了很多方案，也走了很多彎路，所幸最后我們找到了我們認(rèn)為最優(yōu)表達(dá)體系。

第三部分，我們參照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)UOX酶活進(jìn)行了定向進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)突變后雖然粗酶液酶活的V_max有所提升，但是K_m相比不突變時(shí)也增大了，這使得重組菌株在尿酸低濃度條件下的降解能力受到了影響。為了解決這一問題，我們引入了尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgfU，成功解決了這一問題。

將重組菌用于小鼠模型治療的時(shí)候存在哪些挑戰(zhàn)？

在使用重組菌進(jìn)行小鼠高尿酸血癥體內(nèi)治療時(shí)也遇到了較多困難。一個(gè)客觀難題是我們團(tuán)隊(duì)缺少鼠房，很幸運(yùn)的是我們通過跟腸道微生物與菌群互作學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)的王明鈺老師合作解決了這一難題。在真正操作時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)尿酸濃度偏低，尿酸酶在低濃度尿酸下酶活偏低；還發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)建模常用試劑氧嗪酸鉀會(huì)進(jìn)一步抑制工程菌中尿酸氧化酶的活性。這些研究結(jié)果表明傳統(tǒng)的小鼠建模方法并不適用于測定工程細(xì)菌的功能。因此，我們采用靜脈注射尿酸的方法快速提升小鼠血液中尿酸的濃度，建立了構(gòu)建小鼠急性高尿酸血癥模型的新方法。該方法可以在短期內(nèi)模擬人體尿酸的濃度，但只能維持1小時(shí)左右，這表明這種方法仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。但值得一提的是，在這1小時(shí)的窗口期，我們構(gòu)建的工程菌顯著降低了小鼠體內(nèi)的血尿酸濃度，這個(gè)結(jié)果可以證明我們的方法適用于驗(yàn)證工程菌的療效。

工程菌的構(gòu)建、小鼠的急性高尿酸血癥建模與治療方案

您在工作中特別注重研究工具的開發(fā)和優(yōu)化，能否談?wù)勥@方面的心得？

目前工程益生菌的研究非?；馃?，除了EcN菌株外，很多腸道益生菌也都被改造用于疾病的治療。比如將雙歧桿菌Bifidobacterium longum進(jìn)行改造治療癌癥，將乳酸菌Lactobacillus reuteri、Lactococcus lactis以及Lactobacillus gasseri進(jìn)行改造治療腸胃炎、糖尿病等等。美國的ZBiotics公司甚至推出了一款工程化枯草芽孢桿菌用于分解小腸中的乙醇，緩解宿醉。

截止目前，治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的工程菌的相關(guān)研究較少，但是蘭州大學(xué)的李祥鍇教授團(tuán)隊(duì)從漿水中分離的乳酸菌Limosilactobacillus fermentum JL-3以及日本的研究團(tuán)隊(duì)分離出的乳酸菌Lactobacillus. gasseri PA-3都證實(shí)對(duì)高尿酸血癥有一定的治療效果，推測這些菌株具有較強(qiáng)的嘌呤和核酸代謝能力，這些菌株可以降低人體對(duì)嘌呤等物質(zhì)的吸收，進(jìn)而緩解高尿酸血癥。后續(xù)的機(jī)制研究可能會(huì)揭開其具體的機(jī)理。

您在工作中注重研究工具的開發(fā)和優(yōu)化，能否談?wù)勥@方面的心得？

我對(duì)研究工具的開發(fā)主要集中在實(shí)驗(yàn)室的一些常用技術(shù)上，包括克隆、轉(zhuǎn)化與點(diǎn)突變技術(shù)等。我覺得這些技術(shù)是完成基本的克隆操作所必須的，也是實(shí)驗(yàn)室最常用的技術(shù)手段。DNA組裝試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)成為很多實(shí)驗(yàn)室的常用消耗品。于是便產(chǎn)生了一個(gè)問題，如果這些材料全部采用商業(yè)化試劑，價(jià)格會(huì)比較昂貴，個(gè)人配制的話，效率往往又不及商業(yè)化的水平。

基于此，為了解決這一矛盾，我們計(jì)劃去建立一種低成本并且可以媲美商業(yè)化水平效率的DNA克隆和點(diǎn)突變系統(tǒng)。經(jīng)過長期的努力，我們成功建立了一種超低成本的DNA組裝技術(shù)TEDA，又建立了一種簡便可行的超高化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備方法，還修訂并優(yōu)化出一種簡便的DNA點(diǎn)突變方法。我們將這些技術(shù)組合在一起，成功的將DNA克隆的效率去媲美最好的商業(yè)化水平，而所需要的物料成本基本上可以忽略不計(jì)。這些技術(shù)通過本課題組的多次實(shí)踐，表明它們能夠很好得提高克隆的成功率，降低了實(shí)驗(yàn)室的花費(fèi)，還減少了基本實(shí)驗(yàn)操作所消耗的時(shí)間和精力。

近年來工程生物學(xué)的研究亮點(diǎn)頻出，給社會(huì)公眾帶來了很多驚喜和期待。您覺得該項(xiàng)研究成果的產(chǎn)業(yè)化前景如何？

我們很期待可以繼續(xù)推進(jìn)這項(xiàng)研究成果的后續(xù)研究，乃至產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，但我們認(rèn)為還有一段路要走。

本人是個(gè)產(chǎn)業(yè)化的門外漢，但也確實(shí)就推進(jìn)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行了一些思考，在這里談一下自己的淺薄認(rèn)識(shí)，歡迎大家的批評(píng)指正。

1、我們的研究表明，小鼠并不是一個(gè)很好的研究高尿酸血癥的宿主模型（雖然很多文獻(xiàn)都在用）。我們覺得如果要進(jìn)一步嘗試其可行性，需要通過更高等的動(dòng)物進(jìn)行嘗試。但這種研究條件并不是普通實(shí)驗(yàn)室所具備的，需要花時(shí)間和精力尋找有興趣的合作對(duì)象。

2、我們現(xiàn)在是通過質(zhì)粒和傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)的方式來表達(dá)這些重組酶，但在真正應(yīng)用前，應(yīng)該嘗試解決質(zhì)粒穩(wěn)定性與誘導(dǎo)劑的問題。我們正在考慮將重組基因簇插入基因組來使其更加穩(wěn)定，采用氧氣誘導(dǎo)等方式使得其可以在腸道中穩(wěn)定的自發(fā)進(jìn)行。

科研成果實(shí)用化是近年來國家大政所指，這也是我一直以來的理想和愿景。但作為一名科研工作者，一個(gè)人的力量有限，對(duì)真正的產(chǎn)業(yè)化過程理解的也尚淺薄。希望能夠有機(jī)會(huì)結(jié)交更多的有識(shí)之士，對(duì)我們這個(gè)項(xiàng)目給予一些評(píng)估和指導(dǎo)。這些來自市場角度的評(píng)估可能會(huì)方便我們調(diào)整研究方向，讓我們真正朝著產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的目標(biāo)而努力。

您能否跟年輕學(xué)子們分享一下您的心路歷程？

談心路不太敢當(dāng)，自己只是眾多普通青年學(xué)者中的一員，學(xué)術(shù)經(jīng)歷尚淺。如果拿孫悟空學(xué)筋斗云相比，我這最多還在爬云而已。簡單聊聊幾點(diǎn)心得，拋磚引玉吧，不對(duì)的地方，僅供消遣。

能取得這些許進(jìn)步，要特別感謝我本碩博就讀的山東大學(xué)和博士聯(lián)培的德國明斯特大學(xué)對(duì)我的培養(yǎng)。求學(xué)路上遇到了諸多貴人，他們給了我很多幫助。本科期間，班級(jí)學(xué)習(xí)氛圍濃厚，我被帶動(dòng)著掌握了一些專業(yè)知識(shí)，也學(xué)會(huì)了一定的自學(xué)方法，不過當(dāng)時(shí)真沒想到這些會(huì)成為我從事科研工作的基礎(chǔ)，現(xiàn)在想來也是竊喜。碩博連讀早期階段受到了良好的微生物與代謝工程的基礎(chǔ)操作和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培訓(xùn)，期間做了很多有趣的科研嘗試，盡管最終沒有成功，但讓我掌握了更多處理研究中“負(fù)結(jié)果”的心態(tài)和方法，這也成為了我科研生涯的一筆寶貴財(cái)富。在德國明斯特大學(xué)的博士后經(jīng)歷也非常寶貴，不僅增長了我的國際視野，也讓我真正學(xué)會(huì)應(yīng)該如何獨(dú)立思考并去解決具體的科學(xué)問題。

留校任教進(jìn)入了環(huán)境微生物與合成生物學(xué)團(tuán)隊(duì)，在這里我也一直在成長。從一開始PI提出科學(xué)問題自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證，逐漸過渡到自己能產(chǎn)生新想法后去指導(dǎo)學(xué)生。在不斷堅(jiān)持的文獻(xiàn)閱讀中，在組內(nèi)外老師學(xué)生的不斷討論中，視野在開闊，思維在拓展，凝練問題的能力也在增強(qiáng)。這種點(diǎn)滴的進(jìn)步讓我很高興，反過來更加深了我對(duì)科研的興趣。

總體上，要不斷審視并培養(yǎng)適合自己做科研的方法和心態(tài)。面對(duì)研究中不斷出現(xiàn)的問題，要調(diào)整心態(tài)積極去應(yīng)對(duì)，并積累一些適合自己的方法去尋找問題的解決方案，去開拓新思路。積極觀察和學(xué)習(xí)身邊的榜樣也是一種很好的方式，這可以使我們更快地取得進(jìn)步。這樣不斷增強(qiáng)的心態(tài)和累積的能力又會(huì)成為發(fā)展我們科研興趣的不竭源泉。

環(huán)境微生物與合成生物學(xué)團(tuán)隊(duì)的活動(dòng)