導(dǎo) 讀
2021年9月3日，普渡大學(xué)Kevin Solomon團隊在《核酸研究》雜志報告的最新進展顯示：他們確實看到了NgAgo作為 DNA 核酸內(nèi)切酶的活性。本文作者認(rèn)為，這種活性和韓春雨之前報道的并不相同，甚至基本否定了NgAgo在哺乳動物細(xì)胞中基因編輯的可能性。
撰文｜王承志
責(zé)編｜陳曉雪
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自河北科技大學(xué)副教授韓春雨及合作者2016年5月在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志發(fā)表NgAgo可能作為哺乳動物細(xì)胞的基因編輯工具以來，科學(xué)界關(guān)于NgAgo是否真的能夠進行基因組編輯的討論就沒有停止過。因為無法重復(fù)實驗結(jié)果，這篇廣受爭議的論文在發(fā)表一年3個月后即被作者撤回，不過一直有科學(xué)家試圖了解NgAgo和其它Argonaute家族蛋白是否真的有替代CRISPR系統(tǒng)作為基因編輯工具的潛力。
2021年9月3日，普渡大學(xué) Kevin Solomon 團隊在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）雜志報道的最新進展顯示：他們確實看到了NgAgo作為 DNA 核酸內(nèi)切酶的活性，但這種活性和韓春雨之前報道的并不相同。
NgAgo的來源宿主是一種嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi ）。這類微生物生活在高鹽環(huán)境中，它們的蛋白在進化中也適應(yīng)了這種極端環(huán)境，但在普通的低鹽環(huán)境中常常無法正確折疊。
在上述的研究中，研究人員也發(fā)現(xiàn)NgAgo在非嗜鹽宿主（如大腸桿菌）中表達(dá)量很低，且基本以不溶解的形式存在。即使在重折疊后，大多數(shù)NgAgo蛋白仍不能溶解且無活性。
但在細(xì)胞破碎的上清中，有少量以可溶形式存在的NgAgo蛋白。研究人員發(fā)現(xiàn)可溶的NgAgo在體外能夠切割質(zhì)粒和基因組DNA，而且這種活性可以不依賴于向?qū)NA（gDNA）。
進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在有反義gDNA（與靶標(biāo)DNA互補）存在時，絕大部分切割（>97%）發(fā)生在其對應(yīng)的DNA位點，而正義gDNA（與靶標(biāo)DNA序列相同）則不能引導(dǎo)NgAgo發(fā)生切割。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)NgAgo的切割活性是單鏈切割（Nicking），而非像Cas家族蛋白那樣的雙鏈切割。
進一步地，研究人員發(fā)現(xiàn)NgAgo在大腸桿菌中可以在gDNA的幫助下實現(xiàn)基因編輯。這種編輯通常發(fā)生在gDNA 3' 末端外 1 nt 處切割靶向 DNA。實驗還證實了NgAgo的切割活性結(jié)構(gòu)域PIWI對其在大腸桿菌的編輯能力是必要的。
實際上，早在2019年4月，該團隊就在佛羅里達(dá)州奧蘭多城舉行的美國化學(xué)學(xué)會年會上報告了這一發(fā)現(xiàn)，并在預(yù)印本論文平臺bioRxiv上發(fā)布其結(jié)果。但不知為何，直到最近才正式發(fā)表。
這篇研究第一次在體外和體內(nèi)（大腸桿菌中）證實了NgAgo確實有DNA內(nèi)切酶活性，這對于理解NgAgo又前進了一大步。之前的研究顯示NgAgo可以與靶基因結(jié)合以阻斷其轉(zhuǎn)錄，以及其可能有RNA編輯的活性，但沒有人在DNA上真正看到切割活性。
Argonaute家族一些蛋白的特性，例如不需要PAM序列，以及使用DNA而非RNA（容易形成二級結(jié)構(gòu)從而失效）作為向?qū)蛄?，可以彌補CRISPR基因編輯系統(tǒng)的很多不足，因而被生物學(xué)界寄予厚望。
科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它Argonaute家族蛋白，如TtAgo，MpAgo，PfAgoa和MjAgo等確實有基因編輯活性，但都必須在55℃以上的高溫環(huán)境中才能工作，這使得科學(xué)家無法開發(fā)它們成為在細(xì)胞中工作的基因編輯工具。
NgAgo的天然宿主能夠在37℃生長，如果它能在細(xì)胞中實現(xiàn)基因編輯將會大大拓寬基因編輯工具箱的范圍。但后續(xù)的研究無一例外地發(fā)現(xiàn)，NgAgo在細(xì)胞中看不到基因編輯的活性。這將NgAgo這個明星分子推向風(fēng)口浪尖。
Kevin Solomon團隊的這項研究，證實了NgAgo的DNA切割活性，這表明該蛋白可能有成為基因編輯工具的潛力。
但是，這并不代表韓春雨最初的論文結(jié)論被證實。
相反，這篇文章的實驗基本否定了NgAgo在哺乳動物細(xì)胞中基因編輯的可能性。
首先，NgAgo在生理鹽濃度條件下可溶性極差，因此在細(xì)胞中的可溶部分濃度很難達(dá)到基因編輯所需要的量。
其次，和Cas9等內(nèi)切酶相比，NgAgo缺乏DNA解旋酶活性，這極大影響了其編輯效率。因為無法解開雙螺旋，只有細(xì)胞基因組復(fù)制時NgAgo才有機會接觸到單鏈DNA，從而發(fā)揮內(nèi)切酶活性。在這項研究中使用的大腸桿菌細(xì)胞周期很短，基因組復(fù)制占比時間很長，因此能觀察到細(xì)胞內(nèi)編輯活性。對于哺乳動物來說，很長的細(xì)胞周期會使NgAgo難以發(fā)揮編輯功能。
另外，哺乳動物細(xì)胞染色質(zhì)中的組蛋白會抑制NgAgo的活性。大腸桿菌中沒有組蛋白，這有利于NgAgo發(fā)揮作用。
基于這些原因，NgAgo不太可能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因編輯活性，這與之前很多的研究結(jié)果也相吻合。
這項研究將NgAgo的功能研究往前推進了一大步，第一次證實了NgAgo的DNA內(nèi)切酶活性。至于NgAgo是否能被改造為適合哺乳動物細(xì)胞的基因編輯工具，還需要更多的探索。
作者簡介
王承志為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)博士，現(xiàn)任職于某創(chuàng)業(yè)公司。
參考文獻：
1. Lee, Kok Zhi, Michael A. Mechikoff, Archana Kikla, Arren Liu, Paula Pandolfi, Kevin Fitzgerald, Frederick S. Gimble, and Kevin V. Solomon. 'NgAgo possesses guided DNA nicking activity.' Nucleic Acids Research (2021).
2. https://www.eurekalert.org/news-releases/847286
3. Kok Zhi Lee, Michael A. Mechikoff, Archana Kikla, Arren Liu, Paula Pandolfi, Frederick S. Gimble, Kevin V. Solomon doi: https://doi.org/10.1101/597237
