編者按：20世紀 70 年代, Pu rves 發(fā)現(xiàn)了甲胎蛋白異質(zhì)體 (AFP varian t)。之后, 由于某些因素的制約, 迄今尚未廣泛應(yīng)用于臨床。 近年來, 許多中外學(xué)者對AFP 異質(zhì)體進行了更為廣泛而深入的研究。 本文作者殷正豐教授在收集、綜合文獻的基礎(chǔ)上, 對這一課題的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用進行了更為深入的研究, 從而論證了AFP 異質(zhì)體可預(yù)警肝癌的發(fā)生, 其作為診斷肝癌標志物的主要特點為: 此法不受 AFP>400μg/L作為肝癌診斷標準的限制；不受影像學(xué)檢查結(jié)果為陰性的束縛; 有助于鑒別影像學(xué)檢查難以確診的肝占位性病變; 無需動態(tài)觀察AFP 的含量變化, 從而可縮短肝癌的診斷時間。 更具實用價值的是, 可以借助AFP 異質(zhì)體與AFP 檢測值的對比, 判斷患者手術(shù)治療是否徹底, 從而為后續(xù)治療提供重要參考依據(jù)。 本文資料新穎, 行文簡潔, 方法實用, 現(xiàn)推廣于此, 以饗讀者。
作者：殷正豐（第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院分子腫瘤實驗室）
關(guān)鍵詞: 肝細胞瘤; 甲胎蛋白類; 凝集素類; 腫瘤標志, 生物學(xué)
甲胎蛋白 (AFP) 是一個單鏈糖蛋白。 1970 年P(guān)urves 對肝癌病人血清作凝膠電泳時最先觀察到AFP有不同的遷移率。隨著生物化學(xué)及其相關(guān)分析技術(shù)的進展與應(yīng)用, 發(fā)現(xiàn) AFP分子與外源性凝集素的親和力不同, 即存在不均一性的糖鏈異質(zhì)性。 后來, 通常將氨基酸序列相同, 而糖鏈或蛋白質(zhì)等電點不同的AFP 稱為AFP 異質(zhì)體 (AFP variants)。 通過大量研究, 證實AFP分子糖鏈異質(zhì)性與其組織器官來源有關(guān), 不同生理病理狀況可產(chǎn)生不同的糖鏈結(jié)構(gòu), 并且具有腫瘤特異性。AFP 分子糖鏈結(jié)構(gòu)與惡性腫瘤關(guān)系的確立, 開創(chuàng)了根據(jù)蛋白質(zhì)分子糖鏈“質(zhì)”的改變判斷疾病的先河, 在實驗診斷學(xué)領(lǐng)域突破了腫瘤標志物以“量”的異常診斷腫瘤的傳統(tǒng), 有著重要的臨床應(yīng)用價值。
1 AFP 異質(zhì)體檢測方法
自發(fā)現(xiàn)AFP 糖鏈差異以來, 國內(nèi)外不少學(xué)者一直致力于建立各種測定方法, 以期根據(jù)AFP 分子質(zhì)的改變鑒定AFP 的來源。 通過制備針對AFP 不同糖鏈的單克隆抗體, 建立AFP 糖鏈異質(zhì)體直接定量法, 這在理論上似乎是可行的。 然而在實際工作中,由于糖鏈的抗原性很弱, 難以制備出相應(yīng)的單克隆抗體, 或制備出的單克隆抗體的特異性難以達到實驗要求。 鑒于凝集素能專一地識別并結(jié)合某一特定結(jié)構(gòu)的單糖、寡糖或糖鏈中的糖基序列, 目前國內(nèi)外仍沿用、發(fā)展以凝集素為基礎(chǔ)的檢測方法。
1.1 凝集素親和免疫電泳法 將凝集素和瓊脂糖均勻混合后制成凝膠板, 血清點樣后電泳, 與該凝集素結(jié)合的糖蛋白 (包括AFP) 電泳速度降低, 從而與非結(jié)合AFP 分離, 再將凝膠板旋轉(zhuǎn) 90°, 作免疫電泳后借助同位素自顯影, 最后根據(jù)沉淀峰的面積計算結(jié)合力不同組分的百分比 (凝集素親和免疫電泳自顯影法)。最近, 我們對這一方法作了改良, 解決了對單一峰型的結(jié)果難以判斷的問題, 使其更為實用。也可在電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜, 在膜上與AFP 酶標抗體結(jié)合, 經(jīng)顯色后測定各個分離帶。這種凝集素親和免疫電泳印跡法國外已有相應(yīng)的商品化試劑盒。 目前國內(nèi)外在臨床上常采用上述兩種方法, 操作簡便, 重復(fù)性好。
1.2 AFP 異質(zhì)體比率和 AFP總量同時自動分析法以液相競爭 (AFP 單克隆抗體與AFP異質(zhì)體結(jié)合受到凝集素的競爭抑制) 為基礎(chǔ)并與高壓液相層析相結(jié)合的一種自動化免疫測定系統(tǒng), 可同時分析AFP異質(zhì)體比率和AFP總量, 批內(nèi)誤差低于6% , 回收率為 92.6%～ 105.6% , 與凝集素親和免疫電泳法具有良好的相關(guān)性。 目前這一分析系統(tǒng)在日本已進入臨床應(yīng)用。
2 AFP 異質(zhì)體臨床應(yīng)用
AFP 異質(zhì)體檢測方法的建立, 進一步促進了AFP 基礎(chǔ)與臨床研究, 大大擴展了AFP 作為腫瘤標志物的臨床應(yīng)用潛能。現(xiàn)已清楚, 不同疾病產(chǎn)生的AFP 在糖鏈結(jié)構(gòu)上各不相同, 應(yīng)用不同的凝集素親和電泳可以把它們分成若干個組分。 迄今已確定了一些可用于測定AFP 糖鏈異質(zhì)性的植物凝集素, 如刀豆素A(concanavalin A , Con A )、 E 型紅腰豆凝集(phaseo lu s vulgaris agglutin in, PHA-E)、小扁豆凝集素 (lens culinaris agglutin in, LCA ) 或豌豆凝集素 (pisum sativum agglu tin in, PSA ) 等。由于多種限制, 涉及 Con A、 PHA-E 等凝集素的方法并未能得到臨床應(yīng)用。而診斷意義明確、實際應(yīng)用價值大的是 應(yīng)用 LCA 或 PSA 測定AFP異質(zhì)體。 1981 年Breborow icz 等和 Miyazak 等幾乎同時報道了 LCA結(jié)合型AFP 在肝癌診斷中的價值, 并很快得到大量臨床資料的驗證。在最初的試驗中,AFP 經(jīng) LCA 電泳分成 2 個條帶。后來隨著分離技術(shù)的提高, 卵黃囊腫瘤等病人血清AFP 還可分出位于上述 2 個條帶之間的另一個條帶。 根據(jù)3個條帶電泳遷移率大小依次取名為AFP-L 1、AFP-L 2 和AFP-L 3, 分別代表 LCA 非結(jié)合型、 LCA 弱結(jié)合型和 LCA 結(jié)合型。20 世紀 80 年代末, 我們發(fā)現(xiàn)PSA在AFP 異質(zhì)體測定中具有與 LCA 完全相同的應(yīng)用價值 , 從而以自制的、成本較低的 PSA 取代 LCA , 并作為常規(guī)項目 一直在本院臨床應(yīng)用。 目前認為, 通常所說的AFP 異質(zhì)體實際是指與LCA或PSA結(jié)合的AFP-L 3 (下同 ) , 早已列入1999年第四屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議上通過的原發(fā)性肝癌臨床診斷標準的肝癌標記物之一。
2.1 AFP 異質(zhì)體有助于鑒別 AFP 陽性良、惡性肝病，無論采用哪種方法, 國內(nèi)外研究所得的結(jié)果都一致, 即慢性肝病血清AFP 異質(zhì)體百分比很低, 而原發(fā)性肝癌很高, 表明AFP 異質(zhì)體測定非常有助于良、惡性肝病的鑒別診斷。 目前大多以 15% 作為區(qū)分良、惡性肝病的閾值。 新近我們對AFP 低濃度陽性良、惡性肝病的研究表明, 肝癌組血清AFP 異質(zhì)體均數(shù)為 (40.5± 31.2) % , 慢性肝炎組為 (6.4±4.9) % , 肝硬化組為 (6.0± 4.5) %。 而慢性肝炎組、肝硬化組及肝癌組> 15% 的陽性率分別為 4.2%、5.1% 和 84.6% ,差異有極顯著性 (P <0.01)。 匯總文獻提示，AFP 異質(zhì)體對肝癌的總敏感性為 50%～60% , 對大肝癌 (≥ 5 cm ) 的敏感性為 80%～ 90% ,特異性為95%以上, 顯著高于單純AFP定量測定。應(yīng)用AFP異質(zhì)體鑒別良、惡性肝病應(yīng)注意以下問題: (1)AFP 異質(zhì)體上升與血清AFP 值無關(guān), 只要AFP 陽性,AFP 異質(zhì)體就可能升高。我們在臨床檢測工作中已發(fā)現(xiàn)很多患者血清AFP 為 20～ 50μg/L , 而AFP 異質(zhì)體呈陽性, 從而使肝癌得到及早診斷。因此,AFP 異質(zhì)體非常適用于AFP 低濃度陽性良、惡性肝病的鑒別診斷。 (2) 約有 35%～ 45% 小肝癌 (直徑< 2 cm ) 病人已顯示AFP 異質(zhì)體顯著升高。 因此,AFP異質(zhì)體對肝癌早期診斷很有價值。(3)AFP 異質(zhì)體的敏感性和特異性均未達到 100% ,因此存在少數(shù)假陽性或假陰性, 尤其是急性肝炎的假陽性率較高。 當然, 急性肝炎在臨床上較容易排除。 (4)AFP 陰性以及AFP 含量高并已有影像學(xué)檢查結(jié)果支持 (肝癌特征性占位性病變) 的病人不適合作AFP 異質(zhì)體測定。
2.2 AFP 異質(zhì)體有助于預(yù)警肝癌發(fā)生 通過對慢性肝病患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn), 在影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變前數(shù)月乃至數(shù)年,AFP 異質(zhì)體就可能隨肝細胞癌變而在血中升高。比如, 我們曾對 27 例AFP 20～ 400μg/L、影像學(xué)檢查陰性、最后確診為肝癌的病人AFP 異質(zhì)體含量進行動態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)AFP 異質(zhì)體升高較影像學(xué)檢查陽性早出現(xiàn) 3～ 28 個月 ,AFP 異質(zhì)體陽性預(yù)測肝癌發(fā)生的正確率為 94%。后來 Sato等報道,AFP 異質(zhì)體升高的肝硬化病人大多數(shù)在 3～ 18 個月內(nèi)被診斷為肝癌。Shirak i 等對AFP 異質(zhì)體陽性的肝癌病人進行回顧分析后也發(fā)現(xiàn), 在影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變前 12 個月就有 41% 的病人AFP 異質(zhì)體升高?？梢? 在影像學(xué)檢查尚未發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變時, 對AFP 低濃度陽性病例進行AFP 異質(zhì)體檢測可以早期預(yù)警肝癌發(fā)生。
綜上所述,AFP 異質(zhì)體測定用于肝癌定性診斷具有下述優(yōu)點: (1 ) 不受AFP>400μg/L作為肝癌診斷標準的限制；(2) 不為影像學(xué)檢查結(jié)果為陰性的束縛； (3) 有助于鑒別影像學(xué)檢查難以確診的肝占位性病變； (4) 無需動態(tài)觀察AFP含量變化, 從而縮短從AFP含量升高至肝癌確診的時間。
2.3 AFP異質(zhì)體有助于預(yù)測肝癌預(yù)后Yamashita等隨訪了55例治療前AFP 異質(zhì)體均為陰性的肝癌病人, 其中32 例(58% )在治療后AFP異質(zhì)體仍陰性, 23例 (42% )則轉(zhuǎn)為陽性。 陽性組平均生存期顯著低于陰性組, 而且AFP 異質(zhì)體含量與門脈侵犯有關(guān), 陽性組多發(fā)性復(fù)發(fā)與門靜脈癌栓形成多于陰性組。如果該指標轉(zhuǎn)為陽性, 肝內(nèi)遭受侵襲性病變的可能性增加。 另外, Moriwaki 等報道,經(jīng)根治性外科切除或經(jīng)皮無水酒精瘤內(nèi)注射的肝癌病人用維 A 酸治療后, 在AFP 異質(zhì)體消失的同時,未見肝癌復(fù)發(fā)。我們曾隨機選擇 1991～ 1994 年在本院第一次行肝癌根治性切除術(shù)的AFP 陽性肝癌病人作為研究對象, 通過隨訪有關(guān)病例, 收集相關(guān)資料, 分析血清AFP 異質(zhì)體含量與肝癌復(fù)發(fā)率、生存率的關(guān)系, 并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明 ,AFP 異質(zhì)體高含量組和低含量組 1、3、5 年累計復(fù)發(fā)率分別為 32.5% 和 17.4% ; 66.3% 和 45.7% ; 89.2% 和71.7%。高含量組累計復(fù)發(fā)率明顯增高 (P<0.05)。高含量組和低含量組 1、3、5 年累計生存率分別為91.2% 和 97.8% ; 63.8% 和 89.1% ; 38.6% 和65.2%。低含量組生存時間明顯延長 (P < 0.01)。最近 Oka 等分析了388例肝癌病人 (來自于9家日本醫(yī)院) 的臨床資料, 發(fā)現(xiàn)AFP 異質(zhì)體與肝癌惡性特征有關(guān), 特別是門脈侵犯和腫瘤分化程度, 而且AFP 異質(zhì)體>15% 的相關(guān)性比 > 10% 更確定, 而AFP 濃度與惡性特征則無關(guān)。新近 Yo sh ida 等也報道了類似結(jié)果, 認為AFP 異質(zhì)體是惡性生物學(xué)的良好指標, 可作為一個獨立的肝癌預(yù)后標志物指標。
2.4 AFP 異質(zhì)體有助于評價肝癌療效本院對肝癌病人手術(shù)后的隨訪研究表明, 肝癌根治性切除后, 一般在2個月內(nèi)AFP 轉(zhuǎn)陰,AFP 異質(zhì)體也隨之消失。 如果經(jīng)一段時間后AFP 雖明顯下降但未轉(zhuǎn)陰, 而AFP 異質(zhì)體變化不明顯, 則提示手術(shù)不徹底,可能還存在切緣殘瘤、血管癌栓、衛(wèi)星結(jié)節(jié)或肝外轉(zhuǎn)移等。 這是因為主瘤被切除后, 產(chǎn)生AFP 的主要細胞消失,AFP 絕對值減少,AFP 濃度下降, 但體內(nèi)尚存在來源于同一克隆的殘瘤, 仍在不斷產(chǎn)生與主瘤產(chǎn)生的AFP 相同的AFP , 因此AFP 異質(zhì)體在AFP總量中的比例無明顯變化。 另一方面, 如果手術(shù)后AFP 異質(zhì)體隨AFP 含量下降而下降, 一段時間后AFP 不能轉(zhuǎn)陰, 而AFP 異質(zhì)體下降至診斷值以下,以后兩值相對恒定, 提示手術(shù)可能較為徹底, 而余肝尚存在肝炎或肝硬化。因為在這種情形下, 除了肝癌細胞外, 肝炎或肝硬化亦產(chǎn)生少量糖鏈異質(zhì)性不同的AFP。因此, 當腫瘤被切除后,AFP 不能轉(zhuǎn)陰, 但AFP 異質(zhì)體明顯下降。 與上述手術(shù)后AFP 下降但AFP 異質(zhì)體無明顯下降的病人相比, 這類病人的短期療效可能較好。 后來Okuda 等也證實了AFP異質(zhì)體對評估肝癌外科療效具有不同于AFP 含量測定的參考價值。
3 AFP 異質(zhì)體產(chǎn)生的分子機制
據(jù)分析, LCA或PSA特異性地識別、結(jié)合AFP的分子基礎(chǔ)是與肽鏈232位天門冬酰氨相連的 N乙酰葡糖胺上的巖藻糖。 肝癌型AFP之所以與LCA或PSA結(jié)合, 是因為其分子糖鏈上巖藻糖含量較高。 因此在有些文獻中, 用AFP 巖藻糖化指數(shù)取代AFP 異質(zhì)體百分比。 兩者其實是同一個概念。至于肝癌型AFP分子糖鏈改變的機制尚未闡明。與其它糖蛋白一樣,AFP 糖鏈連接與降解過程是在細胞內(nèi)經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶和 (或) 水解酶協(xié)同作用形成的。而肝癌細胞發(fā)生某種或某些作用于糖鏈連接與降解的酶代謝障礙, 則可能導(dǎo)致AFP 巖藻糖基化增高。新近Mita 等報道, 肝癌組織α1-6 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性增高與肝癌形成巖藻糖基化AFP有關(guān)。而α1-6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶參與的催化反應(yīng)是將GDP2巖藻糖上的巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖蛋白 (如AFP )N-寡糖 N-乙酰氨基葡萄糖殘基的還原末斷 (通過α1-6 連接)。
來源：中華檢驗醫(yī)學(xué)網(wǎng)
