概論+抗原抗體反應(yīng)
1 免疫學基本概念及其生物學功能；
免疫：機體識別和排斥抗原性異物的一種生理功能
免疫三大功能：免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視
中樞免疫器官（骨髓和胸腺）外周免疫器官（淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體）
免疫細胞：淋巴細胞（T，B，NK）、單核巨噬細胞、其他免疫應(yīng)答細胞（中性粒、嗜酸性、嗜堿性和肥大細胞）
免疫分子：免疫球蛋白（IgM，IgG，IgA，IgE，IgD），補體，細胞因子，細胞黏附分子，人類白細胞分化抗原
免疫應(yīng)答：機體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生的一系列反應(yīng)，并以排出或分解該抗原為目的的反應(yīng)過程。過程：抗原的識別、處理、信息傳遞（識別階段），免疫細胞的激活、增殖、分化（活化階段）以及產(chǎn)生一系列的免疫效應(yīng)因子（效應(yīng)階段）。
臨床免疫學檢驗：研究免疫學檢測理論、技術(shù)、應(yīng)用，免疫疾病發(fā)病機制、免疫診斷、及防治的一門醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用學科。
免疫學檢測技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，免疫學技術(shù)有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)、中和反應(yīng)和標記免疫反應(yīng)五種類型。
免疫檢驗：1）利用免疫檢測原理和技術(shù)檢測免疫活性細胞、抗原、抗體、補體、細胞因子、細胞黏附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)；2）體液中的微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素。
臨床免疫學：利用免疫學理論和技術(shù)研究疾病的免疫病理機制、診斷和鑒別診斷、療效評價、預(yù)后判斷和預(yù)防的多個分支學科的總稱。
免疫性疾病：各種原因引起的機體免疫應(yīng)答異常所致的疾病，包括超敏反應(yīng)性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。
感染免疫學：研究病原微生物與宿主相互關(guān)系從而控制感染的學科，傳統(tǒng)免疫學核心。
腫瘤免疫學：研究腫瘤免疫原性、機體抗腫瘤的免疫效應(yīng)及機體的免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系以及腫瘤免疫診斷與防治的學科。
移植免疫學：研究移植物與宿主相互關(guān)系從而選擇移植物和延長移植物存活的學科。
2 血清學反應(yīng)的概念；
抗體主要存在于血清中，體外的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學反應(yīng)。
抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，特異性取決于抗原表位和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性，并通過靜電引力、范德華引力、氫鍵結(jié)合力和疏水作用力等非共價鍵結(jié)合在一起。
3 抗原抗體的反應(yīng)原理
Ag決定簇和Ab分子超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補性；分子表面特異的可逆的弱結(jié)合力；親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體
* 親和力（affinity） 是抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)抗原表位之間相互適應(yīng)而存在的引力。這是抗原與抗體之間固有的結(jié)合力。
* 親合力（avidity) 是指反應(yīng)系統(tǒng)中整個抗原分子與相應(yīng)抗體之間的結(jié)合能力。
親和力與親和性、抗體的結(jié)合價和抗原的抗原決定簇數(shù)目相關(guān)。親和力越大，抗原抗體結(jié)合越牢固。
K=抗原抗體復(fù)合物濃度/（游離抗原濃度*游離抗體濃度）
K值大的抗體與抗原牢固結(jié)合，不易解離，說明該抗體有高親和力。
親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體：血清學反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。
當抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變薄，失去親水性能，抗原抗體復(fù)合物成為疏水膠體。 電解質(zhì)作用下，中和膠體表面電荷，使疏水膠體靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。
4 抗原抗體反應(yīng)的特點。
特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性。分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性
交叉反應(yīng)：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)
可逆性： 解離后抗原抗體仍保持原有理化性質(zhì)和生物活性。
影響因素：抗體與抗原間的親合力，親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離；環(huán)境因素－pH、離子強度
比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系。前帶(prezone)：抗體過量。后帶(postzone)：抗原過量。等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適
階段性：親水膠體轉(zhuǎn)疏水膠體的化學和物理變化過程：抗原抗體特異性結(jié)合（幾秒至幾分鐘，不出現(xiàn)可見反應(yīng)），非特異性促凝集（抗原-抗體復(fù)合物在適合溫度pH電解質(zhì)等環(huán)境因素影響下，進一步交聯(lián)和聚集，出現(xiàn)肉眼可見沉淀、凝集、細胞溶解等反應(yīng)，數(shù)分鐘至數(shù)小時）
【熟悉免疫學發(fā)展簡史；抗原及免疫球蛋白的定義及功能
5 抗原抗體的反應(yīng)影響因素。
反應(yīng)物自身因素： *抗原：1.理化特性2.Ag決定簇數(shù)量3.Ag決定簇種類 *抗體：1.來源2.特異性與親和力3.濃度
環(huán)境條件：*電解質(zhì)：0.85%NaCl*使［ Ag-Ab ］表面的電勢下降，失去電荷，破壞水化層，形成凝集或沉淀。濃度過高出現(xiàn)鹽析。
酸堿度：pH6～9*酸凝集：當pH為3左右時，接近細菌Ag的等電點，可出現(xiàn)非特異性凝集。
蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，每種都有固定的等電點。反應(yīng)液中pH過高或過低都可影響抗原或抗體的理化性質(zhì)。
溫度：15～40℃，冷凝集為4℃。在一定范圍內(nèi)，溫度增高，分子運動加快，反應(yīng)速度加快，但結(jié)合不牢固，易解離；溫度低，反應(yīng)速度慢，但結(jié)合牢固。
6 抗原抗體反應(yīng)的類型。
沉淀反應(yīng)；凝集反應(yīng)；補體參與的反應(yīng)；中和反應(yīng)；免疫標記
免疫原和抗體的制備（免疫原和抗血清的制備；單克隆抗體與基因工程）
1 免疫原是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。半抗原是指僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)，與載體結(jié)合后可具有免疫原性。
2 特異性IgG抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等；制備單價特異性抗血清可采用親和層析法和吸附劑方法。
1 可溶性免疫原制備：粗提——組織勻漿制備，細胞的破碎
2 可溶性免疫原提純：超速離心法，選擇性沉淀法，凝膠層析法，離子交換層析法，親和層析法，電泳法
1 多克隆抗體的概念
由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產(chǎn)生的抗體，是多種抗體的混合物。
抗血清是經(jīng)過抗原免疫的動物血清。在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活并產(chǎn)生針對多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。
2 多克隆抗體的制備流程；
免疫原(及佐劑)的制備；免疫動物（動物選擇和動物免疫）；試血；采血收集血清；抗血清的鑒定；抗血清的純化；抗血清的保存
3 免疫佐劑的概念、常見種類及作用機制。
免疫佐劑是先于抗原或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。
氫氧化鋁，明礬，弗氏佐劑(Freund adjuvant)，脂質(zhì)體，細胞因子（乳化方式：研磨法：易乳化，但抗原或佐劑用量大。攪拌混合法：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑，但不易乳化完全）
作用機制：1.改變抗原的物理性狀，使抗原在體內(nèi)滯留或延緩釋放，延長抗原與免疫細胞作用的時間，從而增強抗原免疫原性。2.抗原在佐劑的輔助作用下，更易被巨噬細胞有效吞噬和有效的加工處理和呈遞。3.刺激單核－巨噬細胞活化，釋放細胞因子調(diào)節(jié)和增強淋巴細胞的應(yīng)答能力。4.刺激淋巴細胞增生分化，從而增強和擴大免疫應(yīng)答能力。
應(yīng)用佐劑的缺點：佐劑?；煊形⒘科渌镔|(zhì)，這些物質(zhì)進入體內(nèi)后也可引起抗體的產(chǎn)主，影響抗血清的特異性；注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌性膿腫；反復(fù)注射，易發(fā)生超敏反應(yīng)，使局部組織壞死，甚至引起動物死亡。
4 免疫血清制備
動物的選擇 1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好； 2.動物個體選擇: 適齡、健壯、無感染正常動物、體重合乎要求；3.抗原性質(zhì):酶類—豚鼠；甾體激素—家兔 4.血清用途: R型:等價帶寬,適于診斷試劑.用家兔免疫產(chǎn)生. H型:等價帶窄,適于免疫治療.用馬免疫產(chǎn)生.5.抗血清需要量選擇
免疫方法1.免疫劑量：1)不能過大或過小，否則產(chǎn)生免疫耐受；2)首次免疫劑量不宜過大3)大:0.5-1mg/只 小:0.1-0.6mg/只
免疫途徑:1）皮內(nèi)或皮下注射： a.采用多點注射(8-10點)； b.半抗原宜皮內(nèi)多點注射； c.皮內(nèi)注射易引起細胞反應(yīng)，對提高抗體效價有利，但皮內(nèi)注射較困難(因佐劑加入后粘度大)。2）腹腔和靜脈注射: 多用于顆粒性抗原和加強免疫。3）淋巴結(jié)內(nèi)注射: 適宜于微量抗原(先用完全佐劑在足掌作基礎(chǔ)免疫)。
免疫時間：1）間隔約10-20 天（宜長、否則導(dǎo)致免疫耐受）；2）二次以后每次間隔7~10天（過長→刺激變?nèi)酢?抗體效價不高。）3)一般接種5-8次，不超過2個月；4)半抗原的免疫間隔要求較長(30~40天)。如 8次免疫后仍不產(chǎn)生抗體，則應(yīng)更換動物。
采血及試血頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊；心臟采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、雞 ；靜脈采血法： 家兔、山羊、綿羊
免疫血清的純化：免疫血清是成分復(fù)雜的混合物，除有特異性和非特異性抗體，還有各種蛋白成分
抗血清——硫酸銨鹽析多次（粗提）——親和層析，離子交換層析，凝膠過濾——IgG類抗體（不純）——親和層析，吸附法——特異性IgG抗體
抗體的鑒定：1.效價的鑒定：抗體含量測定。 根據(jù)抗原性質(zhì)不同，顆粒性抗原可采用凝集試驗。可溶性抗原常用免疫雙擴散法 2 抗體的純度鑒定：SDS-PAGE。若只出現(xiàn)一條蛋白電泳區(qū)帶說明抗體純化已達到要求，而出現(xiàn)多條蛋白區(qū)帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進一步純化。 3.特異性鑒定：抗體對相應(yīng)或相似抗原識別能力 一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進行免疫雙擴散試驗。如果出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說明有雜抗體存在。可應(yīng)用相應(yīng)抗原吸收雜抗體，即可得到單價特異性抗體。4 抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好:親和力測定主要有平衡透析法、酶聯(lián)免疫法和放射分析法。親和力的高低是由抗原分子和抗體分子的結(jié)合位點、抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。
免疫血清的保存：1.4℃保存：可保存3～6個月 2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年。抗體的保存濃度為20～30mg/ml為宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的疊氮鈉防腐，并加入等體積的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下低溫保存。 3.冰凍干燥保存：可保存5～10年
4 單克隆抗體的概念
每一克隆B細胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體。
5 淋巴雜交瘤技術(shù)的基本原理
雜交瘤技術(shù)：在細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。
6 單克隆抗體的制備流程
1、親本細胞的選擇（骨髓瘤細胞：BALB/C小鼠骨髓瘤NS-1細胞株和SP2/0細胞株，致敏B細胞：免疫脾細胞，每次抗原用量100μg）2、細胞融合（細胞融合劑——PEG種類:分子量1000、1500、4000的PEG是最常用的細胞融合劑；作用機理：誘導(dǎo)細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合；作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同。）3、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)基，篩選與克隆化
3凝集反應(yīng)
1凝集反應(yīng)的原理及特點；
定義：細菌和紅細胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒性載體與相應(yīng)抗體結(jié)合后，可出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。
概念：顆粒性抗原 + 相應(yīng)抗體↓(適量電解質(zhì))凝集現(xiàn)象，可溶性抗原（或抗體) + 載體顆?！?致敏顆粒+相應(yīng)抗體（或抗原）↓(適量電解質(zhì))凝集現(xiàn)象
特點：1.抗原為顆粒性抗原或可溶性抗原致敏顆粒；2.反應(yīng)時間較短，需幾到十幾分鐘；3.反應(yīng)產(chǎn)物為凝集塊；4.凝集反應(yīng)抗原分子大，反應(yīng)面積小，為使抗體分子不致過多，試驗時需稀釋抗體 。
2 常見的直接凝集反應(yīng)；
直接凝集試驗：顆粒性抗原在有電解質(zhì)的參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。
凝集原(agglutinogen)：凝集反應(yīng)中的抗原
凝集素(agglutinin)：凝集參與反應(yīng)的抗體
分類：玻片凝集實驗（將已知抗體與待測顆粒抗原直接低價在玻片上，混勻并在室溫下反應(yīng)數(shù)分鐘，用肉眼或低倍鏡觀察有無凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。方法評價：簡便、快速；定性檢測方法； 但敏感性較低。臨床應(yīng)用：主要用于菌種鑒定和血清學分型，也可檢測病人血清中有無相應(yīng)的抗體；用于人類ABO血型鑒定。），試管凝集實驗（顆粒性抗原（如細菌或紅細胞等）與相應(yīng)抗體在試管中直接結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。方法評價：經(jīng)典的半定量試驗；敏感性不高；干擾因素多，影響特異性；操作較簡單。臨床應(yīng)用：用已知抗原測定血清中有無相應(yīng)抗體及其含量，輔助臨床診斷疾病或流行病學調(diào)查。如外斐試驗、肥達試驗、交叉配血試驗。）
3 間接凝集反應(yīng)的分類及常見試驗。
間接凝集試驗：將可溶性抗原(或抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏載體顆粒，再與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)的參與下，出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。
載體(carrier)：試驗體系中與免疫無關(guān)的顆粒。
致敏：抗原(或抗體)偶聯(lián)于顆粒表面的過程。
致敏顆粒（sensitized particle): 吸附有已知抗原或抗體的顆粒。
（正向間接凝集反應(yīng)：用抗原致敏載體，檢測標本中有無相應(yīng)抗體。先將可溶性抗原結(jié)合與載體顆粒，然后與待測標本中的抗體反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見凝集顆?；驂K。反向簡潔凝集反應(yīng)：用特異性抗體致敏載體，檢測標本中有無相應(yīng)抗原。簡潔凝集抑制反應(yīng)：用抗原致敏載體，聯(lián)合相應(yīng)抗體檢測標本中是否存在于致敏抗原相同的抗原。
協(xié)同凝集反應(yīng)：金黃色葡萄球菌的細胞壁中含有A蛋白(staphylococcus protein A,SPA)，SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，利用該特性與IgG抗體相連制成抗體致敏的顆粒載體，當它與相應(yīng)抗原反應(yīng)時出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象即叫協(xié)同凝集試驗。
類風濕因子檢測： 原理:：類風濕因子（ rheumatoid factor RF）是由于細菌、病毒等感染因子，引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG（一種抗體）為抗原的一種自身抗體。IgM型為主要類型.
IgG吸附于聚苯乙烯膠乳顆粒上作為檢測試劑，在反應(yīng)介質(zhì)中，待檢血清中如含有RF，可與膠乳顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)。
操作步驟:：在3塊載玻片上分別加一滴RF陽性血清、RF陰性血清及待檢血清；加一滴IgG致敏的膠乳于各血清樣品中，輕微晃動載玻片混勻.；1min 后觀察凝集反應(yīng)發(fā)生情況.
注意事項:器材要潔凈、血清要新鮮、以確保結(jié)果可靠.；注意陰性、陽性對照的設(shè)立.；注意血清及致敏膠乳加樣量的比例.）
紅細胞為載體：間接血凝試驗（可溶性抗原吸附于人O型紅細胞或綿羊、家兔紅細胞上，制備成抗原致敏的紅細胞，然后與相應(yīng)抗體作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，作用一定時間后可出現(xiàn)肉眼可見的紅細胞凝集現(xiàn)象。方法評價：敏感性高于直接凝集試驗和膠乳凝集試驗；操作簡便易行、快速、成本低廉。）
聚苯乙烯膠乳微粒為載體：膠乳凝集試驗
間接凝集反應(yīng)特點：敏感、快速、操作簡便、不需特殊儀器；檢測范圍廣(各種抗體和可溶性抗原)。敏感性比直接凝集反應(yīng)高。
間接凝集反應(yīng)應(yīng)用：抗原的檢測：抗體的檢測：感染性疾病、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病。
4抗球蛋白試驗原理及應(yīng)用；
利用抗球蛋白抗體作為第二抗體起橋聯(lián)作用，鏈接與紅細胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細胞凝集，用于檢測抗紅細胞不完全抗體。
直接Coombs試驗：新生兒溶血癥，自身免疫性溶血癥，特發(fā)性自身免疫性貧血（患者紅細胞上不完全抗體）
間接Coombs試驗：檢測母體Rh（D）抗體，紅細胞不相容輸血后產(chǎn)生的血型抗體測定（血清中游離的不完全抗體）
由于不完全抗體只能與一個RBC的決定簇結(jié)合，而不能同時與兩個RBC的決定簇結(jié)合，而抗球蛋白抗體作為第二抗體可達到連接與RBC表面抗原結(jié)合的特異性抗體，使RBC凝集。
針對于不完全抗體(IgG抗體)的檢測。
4 沉淀反應(yīng)
0 沉淀反應(yīng)
沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象.根據(jù)沉淀反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法的不同，將其分為液體內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉淀試驗和凝膠免疫電泳試驗三大基本類型。
免疫濁法度測定為液體內(nèi)沉淀試驗；單向擴散試驗平板法是一種定量的凝膠內(nèi)沉淀試驗，免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物，常見的有對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳等。
【鉤狀效應(yīng)：由抗原過量引起，導(dǎo)致形成的免疫復(fù)合物分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少的現(xiàn)象。
【海德堡曲線：抗體過量反應(yīng)體系中，抗體過量時，免疫復(fù)合物形成隨著抗原遞增至抗原抗體比例最適合處達到最高峰，沉淀反應(yīng)明顯，而當抗原過量時，形成的免疫復(fù)合物逐漸減少，呈現(xiàn)一個拋物線形曲線。
1 （凝膠內(nèi)沉淀實驗）單向免疫擴散實驗原理和應(yīng)用Mancini曲線和Fahey曲線
原理：將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴散，在二者濃度比例合適處一定區(qū)域內(nèi)形成可見的白色沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原濃度成正相關(guān)。
Mancini曲線：大分子抗原（IgM）和長時間擴散（>48）的結(jié)果處理。K=C（抗原濃度）/d的平方（沉淀環(huán)直徑）
Fahey曲線：小分子抗原和擴散時間較短（24h）的結(jié)果處理。K=logC/d
應(yīng)用：原用于定量測定IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)帖蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等血漿蛋白。
2 雙向免疫擴散實驗應(yīng)用
將抗原和抗體溶液分別放在凝膠的對應(yīng)孔中，讓兩者在凝膠中自由擴散，當抗原與抗體相遇在濃度比例適當處形成可見的白色沉淀線。
應(yīng)用：1）血清學診斷2）免疫化學分析：沉淀線位置主要與抗原、抗體兩者濃度比例有關(guān)，沉淀線靠近抗原空，提示抗體含量高；靠近抗體空，提示抗原含量多。分子量大擴散慢，擴散圈小，形成的沉淀線彎向分子量大的一邊。如二者分子量相對，則形成直線。3）抗體效價滴定：固定抗原濃度，稀釋抗體；或抗原抗體雙方做不同稀釋，經(jīng)自由擴散，一出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。4）分析抗原性質(zhì)5）鑒定抗原或抗體純度：多條沉淀線不純
3 定向免疫擴散原理（對流免疫電泳，火箭免疫電泳）
定向免疫擴散：在電場作用下，抗原或抗體或二者在凝膠介質(zhì)中定向移動發(fā)生的沉淀反應(yīng)。
對流免疫電泳：將雙向免疫擴散與電泳結(jié)合在直流電場中的定向加速的免疫擴散技術(shù)，常用語抗原或抗體定性分析、效價測定和純度鑒定。
在pH8.6的巴比妥緩沖液制備瓊脂凝膠板，抗體因等電點高、帶微弱的負電荷，且分子量較大，因此在電場中的電泳力小于電滲力，泳向負極；而一般抗原蛋白帶較強的負電荷，且分子量較小，電泳力大于電滲力，泳向正極。電泳時，抗原孔放于靠近負極一側(cè)，抗體孔放于靠近正極的一側(cè)，抗原抗體相對泳動，在兩孔間相遇，比例合適時可形成肉眼可見的沉淀線。
火箭免疫電泳：在抗原電場作用下，在凝膠中定向移動、加速發(fā)生的單相免疫擴散。用于IgA、IgG、IgM和sIgA，不同成分C3、C4以及裂解產(chǎn)物AFP等血漿蛋白檢測、
在瓊脂糖凝膠板一端打孔、定量加樣后，樣品孔至于電泳槽負極端。抗原在電場作用下，并與凝膠中的抗體反應(yīng)，逐漸形成梯度濃度，使沉淀帶越來越窄，在抗原、抗體比例適當時形成火箭峰樣沉淀，峰高低與抗原量呈正相關(guān)。
4 定向-自由聯(lián)合免疫擴散（免疫電泳原理和應(yīng)用）
免疫電泳：先將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中做區(qū)帶電泳，根據(jù)其所帶電荷、分子量和構(gòu)型不同分成不可見的若干區(qū)帶，然后沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，進行雙向擴散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。用于分析純化后的抗原或抗體成分分析，粗略分析其純度；正常及異常體液中免疫球蛋白的識別和鑒定：無丙種球蛋白血癥、冷球蛋白血癥、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝病等患者的血清蛋白成分的分析；多發(fā)性骨髓瘤血清M蛋白的檢測和鑒定。
免疫固定電泳：在血清蛋白區(qū)帶電泳后，將抗血清或浸透抗血清的乙酸纖維素或濾紙條放在區(qū)帶表面而不是旁側(cè)槽中，使抗體與對應(yīng)抗原直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，使抗原被固定在電泳位置上，對樣品中所含成分及其性質(zhì)進行分析鑒定，用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白。
5 免疫濁度分析技術(shù)（液相中沉淀反應(yīng)）原理、方法和分類；影響因素（心血管病、血液病、腎功能、神經(jīng)系統(tǒng)。免疫功能。營養(yǎng)狀態(tài)以及藥物濃度的檢測和分析）
原理：可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，兩者比例適合和增濁劑作用下，課快速形成一定大小的免疫復(fù)合物，使反應(yīng)出現(xiàn)濁度。
免疫濁度分析影響因素（抗體的質(zhì)量：特異性高、效價高、親和力強和使用R型抗體，抗原抗體比例，反應(yīng)的條件：pH6.5~8.5，，離子強度大，增濁劑，標本的因素）
透射免疫比濁法：當一定波長（340nm）的光線通過抗原抗體反應(yīng)混合液時，由于抗原-抗體復(fù)合物形成使入射光被反射、吸收或散射而減弱，入社光被吸收的兩與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)?！井斂贵w量保持過剩時，怎就抗原量導(dǎo)致免疫復(fù)合物增多、吸光度增強。加入增濁劑聚乙二醇（PEG）8000（消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進特異性抗原、抗體分子靠近并結(jié)合成大分子復(fù)合物 終點法縮短反應(yīng)時間，速率法 增加反應(yīng)峰值）能加速免疫復(fù)合物形成。
散射免疫比濁法：用激光照射液相中抗原-抗體符合物微粒時部分光線發(fā)生散射，通過測定免疫復(fù)合物引起的光的散射強度（復(fù)合物大小、形狀和輸了）來測定抗原含量?！井斂贵w保持過剩，反應(yīng)也中加入PEG，增加抗原量會導(dǎo)致散射光快速加強?！窘K點散射比濁法：當抗原抗體相遇后免疫反應(yīng)立即開始，達到平衡10~30min在復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前。 速率散射比濁法：單位時間內(nèi)抗原與抗體反應(yīng)速度或免疫復(fù)合物形成的量；在抗體過量的情況下，隨著抗原量增加，反應(yīng)速度越來越快，棉衣服和物量也迅速增加，出現(xiàn)峰值所需時間隨之縮短【25S】
6 抗原性質(zhì)分析出現(xiàn)哪三種結(jié)果現(xiàn)象？結(jié)果解釋？
形成的沉淀可出現(xiàn)：相吻、相交、相切三種現(xiàn)象
解釋：互相吻合相連：抗體與兩種抗原中的相同表位結(jié)合形成沉淀，但不能說明兩種抗原完全相同
相交：兩種抗原完全不同
相切：兩種抗原部分相同
5 放射免疫技術(shù)：
【放射免疫技術(shù)：一放射性核素作為示蹤物的一種免疫技術(shù)。
【放射性核素：自然條件下課發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化，由一種核素轉(zhuǎn)變成另一種核素，并同時放出射線。
【放射性標記物：采用氯胺T方法將放射性核素鏈接在抗原或抗體分子上所形成的復(fù)合物
【比放射活性：單位質(zhì)量標記物所含的放射性強度，每分子抗原評價所結(jié)合的放射性園子數(shù)目
【放射化學純度：在標記物中結(jié)合在抗原上的放射活性占該標記物總放射活性的百分比
1 放射免疫分析RIA的原理、評價
原理：標記抗原和非標記抗原對限量特異性抗體的競爭結(jié)合反應(yīng)。*AgAb信號強度與待測抗原呈反比例關(guān)系。用PEG沉降免疫復(fù)合物，傾倒過剩*Ag，測定沉淀物放射強度，繪制標準曲線。
評價：RIA敏感度高ug/L，與結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)見的交叉反應(yīng)少，特異性強，重復(fù)性好，批間批內(nèi)誤差小，標本用量少。【放射性核素易衰變，放射性標記物不穩(wěn)定，試劑有效期短，核素易對環(huán)境和實驗室造成污染。
2 免疫放射分析IRMA原理、評價
原理：以過量放射性標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)。固相抗原免疫吸附劑（【直接法檢測半抗原。 雙抗體夾心先用固相抗體與抗原反應(yīng)，再與過量的標記抗體作用，形成固相抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后洗滌除去游離的標記抗體，測定固相上的放射量【多價抗原）。Ag-*Ab的放射性強度與待測抗原量呈正比關(guān)系
評價：敏感性高，兩個表位不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性。穩(wěn)定性好，標記抗體和固相抗體均屬過量，不易受外界影響，加樣誤差不大。抗體用量偏多，抗體特異性純化較難。
3 相互比較，應(yīng)用
IRMA&RIA被標記物：抗體，抗原。標記物用量：過量，定量較小。反應(yīng)速率：快，稍慢。反應(yīng)方式：非競爭性結(jié)合，競爭。特異性：高，稍差?？乖瓩z測濃度范圍：寬，較窄。分離技術(shù)：PEG-雙抗體法，固相吸附法。應(yīng)用范圍：小分子半抗原，大分子抗原或抗體。
RIA應(yīng)用：技術(shù)優(yōu)勢（靈敏度高，特異性高，商品化實際，適合測定小分子半抗原）臨床應(yīng)用（血清激素水平測定；病原體抗原或抗體測定，感染性疾病輔助診斷；血清腫瘤標志物測定，腫瘤輔助診斷和評價療效；藥物測定）
6熒光免疫技術(shù)
1 熒光基本知識，熒光物質(zhì)
【熒光免疫技術(shù)：將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種免疫分析技術(shù)。
【熒光抗體染色技術(shù)：用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測。（熒光免疫顯微技術(shù)：直接法、間接法、補體結(jié)合法和雙標記法。）免疫熒光測定術(shù)：時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定。
【熒光猝滅：熒光分子在某些理化因素作用下，熒光分子的輻射能力受激發(fā)光較長時間的照射后會減弱的現(xiàn)象。
【熒光素：能產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機化合物
【Stokes位移：選擇熒光物質(zhì)作為標記物時，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差。
【熒光素影響因素：pH（熒光光譜改變，強度降低）、溫度（20℃以上，熒光溫度猝滅）、熒光素濃度、雜質(zhì)（溶劑中不發(fā)光物質(zhì)：溴化物、碘化物、氨基苯）、細胞固定劑、化合物（苯胺、酚、硝基苯、鹵化物）
【FITC：異硫氰酸熒光素，黃綠色熒光，易溶于水和乙醇。RB200：四乙基羅丹明，不溶于水，溶于乙醇和丙醛，橘紅色。TRITC四甲基異硫氰酸羅丹明，橙紅色，與FITC配合用于雙標記。PE：藻紅蛋白，紅色，流式熒光免疫技術(shù)中PE&FITC共用一個激發(fā)光。
【鑭系稀土元素Eu3+螯合物激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，用于時間分辨熒光免疫測定。
2 熒光標記物制備
熒光素標記抗體攪拌法：標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。
熒光素標記抗體純化：透析法和凝膠柱層析法去除游離的熒光素，DEAT-纖維素離子交換層析去除未標記及過度標記的抗體。
鑭系稀土元素標記物制備：元素離子不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，用有雙功能基團的螯合劑，將稀土元素與抗體或抗原分子的氨基偶聯(lián)。
常用螯合劑：多羧基類、白塔-二酮體類、BCPDA
標記方法：抗體和完全抗原直接標記，小分子半抗原先與大分子載體蛋白連接，再標記Eu3+
3 熒光免疫顯微技術(shù)原理，評價，標本制作
原理：以熒光顯微鏡為檢測工具，用熒光素標記特異性抗體或抗抗體，檢測固定組織細胞上的抗原或血清中的抗體，常用于定性和定位檢查。
標本制作：（組織切片、印片、涂片、單層培養(yǎng)細胞）（玻片：用無自發(fā)性熒光的優(yōu)質(zhì)玻片，厚度在 0.8至1.2mm；用無水乙醇和乙醚浸泡后使用）固定（作用 ： ①防止標本從玻片上脫落； ②除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標本易于保存，原則：①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；②不能凝集蛋白質(zhì)；③不能損傷細胞形態(tài)；④固定后應(yīng)保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結(jié)合。，染色，37℃30min，4℃過夜。
評價：組織學中抗原或抗體的定位、定性檢查，高度特異性和形態(tài)直觀。熒光容易消退，難以制備永久性標本，非特異熒光干擾。
4 間接免疫熒光法檢測ANA原理和運用過程，判斷
用熒光素標記抗體與標本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用熒光素標記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物中的第一抗體結(jié)合，洗滌干燥后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，檢測未知抗原或抗體。用于檢測自身抗體，病原體檢測，免疫病理分析。
5 熒光免疫測定技術(shù)（時間分辨熒光免疫測定）
時間分辨熒光免疫測定：以鑭系元素標記抗體或抗原，并用時間分辨測定技術(shù)相結(jié)合的新型非放射性微量分析技術(shù)。
鑭系元素熒光壽命長，10三次方到六次方倍，用時間分辨熒光測定儀延緩測量時間，可排除標本中非特異熒光干擾，得到稀土元素螯合物發(fā)射的特異性熒光。光譜激發(fā)光與熒光的波長差別明顯，Eu3+被激發(fā)的熒光光帶窄，發(fā)射峰尖銳，可在極窄的波長范圍內(nèi)測定。（時間延遲和波長分辨）
7 酶免疫技術(shù)：
1 基本概念
酶免疫技術(shù)：以酶為標記物，將酶催化底物的高效性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的免疫技術(shù)。
【一步法優(yōu)缺點：（簡化流程，縮短試驗時間）鉤狀效應(yīng)：標本中待測抗原濃度過高，抗原較容易與酶標抗體結(jié)合，而未與固相抗體結(jié)合，，不能形成夾心復(fù)合物，最總測定結(jié)果低于實際含量。假陰性。
2 酶標記物制備（供氫體，波長）
HRP：辣根過氧化物酶，由糖蛋白和亞鐵紅素結(jié)合而成。
OPD：鄰苯二胺，黃色，最大吸收波492nm
TMB：四甲基聯(lián)苯胺，酶作用后天藍色，加酸終止酶變黃色，450nm。
ALP：堿性磷酸酶；白塔-半乳糖苷酶：大腸埃希菌的四聚體蛋白，用于均相酶免疫測定。
3 ELISA酶聯(lián)免疫吸附法原理、評價（雙抗夾心法：兩步法、一步法優(yōu)缺點；間接法；競爭法；捕獲法）
ELISA：把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面（免疫吸附），并將抗原或抗體與酶連接形成酶標記抗原或抗體（酶聯(lián)），測定時將待測抗原或抗體和酶（標記）抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，通過洗滌的方法將固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他成分分離，結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量形成一定比例，通過底物顯色的方式定性或定量檢測有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)的含量。
①雙抗體夾心法：測定大分子抗原，含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，形成固相抗體；加入待測樣本并溫育，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌除去其他游離成分；然后加入酶標抗體溫育，形成（固相抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物），洗滌除去游離酶標記抗體；加底物，根據(jù)產(chǎn)物顯色程度進行抗原的定性或定量檢測。
②間接法：檢測抗體最常用。酶標抗體IgG
③競爭法：抗原和半抗原的定量檢測。先用特異性抗體寶寶固相載體，然后同時加入待測抗原和酶標記抗原，待測樣本中的抗原與酶標抗原競爭性的與固相載體上的特異性抗體結(jié)合，溫育一定時間后洗滌，加底物顯色，顯色深淺與標本含量呈負相關(guān)。
④捕獲法：血清中特定抗體Ig類別測定，病原體急性感染診斷中的IgM型抗體檢測。首先將針對IgM的地兒抗體寶寶與固相載體形成固相抗體，加入待測標本后，標本中所有IgM即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其余固相載體上捕獲的IgM特異性抗體結(jié)合，在加入針對特異性抗原的酶標記抗體，形成固相抗人μ鏈-IgM-抗原-酶標抗體復(fù)合物，加入底物顯色。
3 包被概念和方法，封閉；抗體匹配試驗
【包被：將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上的過程。
【包被方法（加樣，洗板）：用包被緩沖液（pH9.6碳酸鹽，pH7.4磷酸鹽）將欲包被的抗原或抗體稀釋到一定濃度（3~10ug/ml），包被提及為100~150ul/well。包被條件37攝氏度2~6h或4攝氏度過夜。用于包被的蛋白質(zhì)濃度（10ng/ml-20ng/ml）不宜過大，以免形成多層聚集。
【封閉：1~5%牛血清白蛋白或5~20%小牛血清在包被一次反應(yīng)板，高濃度蛋白占據(jù)空白位點（包被液蛋白濃度很低，造成固相載體表面常剩余少量未吸附位點，課非特異地吸附標本中的蛋白質(zhì)及酶標記物，形成非特異性結(jié)合導(dǎo)致本底偏高）消除干擾。
【抗體匹配試驗：雙抗體夾心法測定抗原，當使用兩種單克隆抗體作為固相抗體和酶標抗體時，需進行抗體匹配試驗，一避免空間位阻等其他不利于夾心復(fù)合物形成的影響因素，獲得較好的工作曲線。
4 免疫印跡實驗原理、應(yīng)用
【酶免疫印跡實驗：以膜為固相載體將蛋白質(zhì)抗原直接吸附或通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至膜載體表面，形成固相抗原，加入特異性抗體和酶標記抗抗體，溫育后形成免疫復(fù)合物存在于膜表面，加底物顯色通過膜表面形成有色斑點或條帶判定檢測結(jié)果。（斑點酶免疫實驗，酶免疫滲濾實驗，酶免疫層析實驗，免疫印跡實驗）
【三個階段：SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)（陰電荷，聚丙烯酰胺凝膠，分子量越小，涌動速度越快。分子量大小分成若干區(qū)帶），蛋白區(qū)帶轉(zhuǎn)?。娹D(zhuǎn)移：凝膠-膜夾層組合完全浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中，放入鉑絲電極的緩沖液槽；浸有轉(zhuǎn)印緩沖液的吸水紙之間，兩個石墨平板電極），免疫反應(yīng)與顯色（HRP底物為二氨基聯(lián)苯胺DAB，棕色。不同分子量蛋白參照品，可確定各抗原租房分子量）。
【應(yīng)用：均相酶免疫分析：藥物等小分子物質(zhì)的檢測。ELISA：多種傳染病的實驗室診斷，病毒學檢測、細菌學檢測、免疫球蛋白、不同、腫瘤標志物檢測。EIBT：抗原組分及其免疫活性分析，艾滋病，自身抗體譜測定，ENA?！?/p>
5 生物素-親和素系統(tǒng)特點，相關(guān)酶免疫技術(shù)原理
【 BAS特點：特異性高，靈敏度高（親和素同時與4個生物素分子結(jié)合，以及生物分子抗原或抗體可結(jié)合多個生物素分子產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)），穩(wěn)定性強（不可逆反應(yīng)，抗酸堿能力強），實用性強（可與多種示蹤物質(zhì)如酶、熒光素、鐵蛋白、放射性核素等聯(lián)合用于抗原-抗體、配體-受體、核酸雜交等多種生物學反應(yīng)體系，也可作為親合介質(zhì)用于上述反應(yīng)物的分離、純化。）。
【BAB法：以標記生物素分子為特點，以游離親合素為橋，借助生物素化抗體連接抗原-抗體系統(tǒng)，借助生物素化酶連接信號檢測系統(tǒng)。以游離親和素劇中，分別連接生物素化大分子反應(yīng)體系和標記生物素。
【LAB法：以標記親和素為特點，將示蹤物質(zhì)（酶，熒光素）標記在親和素分子上，借助生物素化抗體再與抗原-抗體系統(tǒng)進行偶聯(lián)。
【ABC法：預(yù)先按一定比例將親和素與生物素標記示蹤物質(zhì)混合，形成可溶性的親和素-生物素化酶標復(fù)合物，同時確保預(yù)留一定位點再與生物素化的抗體結(jié)合，與抗原-抗體系統(tǒng)進行偶聯(lián)。
