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第七章 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法
細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的方法之一，利用顯微鏡對(duì)細(xì)菌的大小、形態(tài)、排列、結(jié)構(gòu)和染色性等特點(diǎn)進(jìn)行觀察分析，可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步識(shí)別和分類，為進(jìn)一步做培養(yǎng)和鑒定提供依據(jù)。
一、不染色標(biāo)本：
細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要觀察活菌的動(dòng)力和運(yùn)動(dòng)情況。
懸滴法或壓滴法觀察活菌運(yùn)動(dòng)。
二、染色標(biāo)本：
(一)、染色標(biāo)本檢查的一般程序：涂片 → 干燥 → 固定 →染色：(初染 → 媒染 → 脫色 →復(fù)染)
三、常用染料
1、堿性染料：常用的染料有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、亞甲藍(lán)等。
2、酸性染料：常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。
3、復(fù)合染料：如瑞氏染料(伊紅亞甲藍(lán))、吉姆薩染料(伊紅天青)等。
四、常用的染色方法
革蘭染色法(Gram`s stain)：本法是細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典，最常用的染色方法。
1、染液：染液、碘液(盧戈碘液)、95%酒精、或沙黃。
2、 步驟：制片：涂片 → 干燥 → 固定→染色
3、染色：初染(結(jié)晶紫1min) → 媒染(碘液 1min)→ 脫色 (95%酒精30s)→ 復(fù)染(稀釋石炭酸復(fù)紅30s)
4、原理：細(xì)胞壁學(xué)說，等電點(diǎn)學(xué)說，核糖核酸鎂鹽學(xué)說。
5、結(jié)果：紫色 → G 菌; 紅色 → G-菌。
6、意義：鑒定細(xì)菌;選擇藥物;了解細(xì)菌的致病性。
7、影響因素
①操作因素：影響革蘭染色的關(guān)鍵步驟是脫色，②染液因素：染液放置過久可能會(huì)因水分蒸發(fā)、化學(xué)沉淀等原因而降低濃度。③細(xì)菌因素：不同時(shí)期的細(xì)菌標(biāo)本或培養(yǎng)物，染色結(jié)果會(huì)有所差異。一般細(xì)菌染色應(yīng)選用新鮮標(biāo)本或培養(yǎng)18-24的細(xì)菌培養(yǎng)物。
抗酸染色法：分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含大量脂質(zhì)(主要是分枝菌酸)，一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時(shí)間來促使其著色，可一旦著色，又能抵抗酸酒精脫色，故名抗酸染色。
1、染液：5%石炭酸復(fù)紅、3擦邊球0鹽酸酒精、呂氏亞甲藍(lán)液。
2、染色方法：將固定好的標(biāo)本片滴加5%石炭酸復(fù)紅并加熱至冒蒸汽初染5min，冷卻后用細(xì)流水沖洗，再用3%鹽酸酒精脫色直至菌膜無紅色脫出為止，大約30，用細(xì)流水沖洗，最后用呂氏亞甲藍(lán)復(fù)染，用細(xì)流水沖洗，干燥后鏡檢。
3、結(jié)果：紅色為抗酸菌，藍(lán)色為非抗酸菌，背景也為藍(lán)色。
其它特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色。
第八章 細(xì)菌的人工培養(yǎng)
培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是指用人工方法配制的適合于細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。
（一）培養(yǎng)基的成分和作用
1.營養(yǎng)物質(zhì)
(1)肉浸液 肉浸液可為細(xì)菌提供氮源和碳源。
(2)牛肉膏 營養(yǎng)價(jià)值低于肉浸液，但因無糖可用作腸道桿菌鑒別培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
(3)蛋白胨：蛋白胨是制備培養(yǎng)基時(shí)最常用的成分之一，主要提供細(xì)菌生長繁殖的氮源。
(4)無機(jī)鹽類：其中最常用的有氯化鈉和磷酸鹽。
(5)糖類與醇類：為細(xì)菌生長提供碳源和能源。
(6)血液既含有營養(yǎng)物質(zhì)，又能提供生長因子，所以用于培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌。另外，還可根據(jù)細(xì)菌在血液培養(yǎng)基中的溶血現(xiàn)象而進(jìn)行鑒定。
(7)雞蛋和動(dòng)物血清 僅用于制備一些特殊的培養(yǎng)基。如培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的雞蛋培養(yǎng)基和培養(yǎng)白喉?xiàng)U菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。
(8)生長因子 常在培養(yǎng)基中加入維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生長因子。
2.水
水是細(xì)菌代謝過程中最重要的物質(zhì)，菌體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。
3.凝固物質(zhì)
制備固體培養(yǎng)基時(shí)，需要在液體培養(yǎng)基中加入凝固物質(zhì)。最常用的凝固物質(zhì)為瓊脂。
4.指示劑
常用的有酚紅(酚磺酞)、中性紅、甲基紅、溴甲酚紫、堿性伊紅、溴麝香草酚藍(lán)和中國藍(lán)等酸堿指示劑。美蘭和刃天青常用作氧化還原指示劑。
5.抑制劑
在培養(yǎng)基中加入一定種類的抑制劑，目的在于抑制非檢出菌(非病原菌)的生長，以利于檢出菌(病原菌)的生長。常用的有膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、玫瑰紅酸、亞硒酸鈉、亞碲酸鹽、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。
(二)培養(yǎng)基的種類
1、按營養(yǎng)組成分：
(1).基礎(chǔ)培養(yǎng)基：肉湯。含牛肉浸液和蛋白胨。廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗(yàn)，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
(2).營養(yǎng)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長因子的細(xì)菌生長。如血瓊脂平板、巧克力血平板。
(3).鑒別培養(yǎng)基：觀察細(xì)菌生長過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物通過指示劑顯示來鑒別細(xì)菌。如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)瓊脂和動(dòng)力-吲哚-尿素(MIU)培養(yǎng)基等。
(4).選擇培養(yǎng)基：加入抑制劑抑制標(biāo)本中雜菌生長，有助于所選擇的細(xì)菌種類生長(SS瓊脂)。
(5).特殊培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基(皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基、高滲培養(yǎng)基)等。
2、按物理狀態(tài)分：
液體(增菌);半固體(觀察動(dòng)力);固體平板(分離單菌落);固體斜面(保存菌種)。
(三)培養(yǎng)基的制備
(四)培養(yǎng)基制備的一般程序：
配料→溶化→矯正PH→過濾→分裝→滅菌→檢定→保存。
分離培養(yǎng)基的選擇
根據(jù)標(biāo)本來源、培養(yǎng)目的、可能存在的病原菌。
1.營養(yǎng)肉湯：標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。
2.血平板：各類細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離。
3.巧克力血平板：疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。
4.中國藍(lán)平板或伊紅亞甲藍(lán)平板：篩選革蘭陰性細(xì)菌;鑒別發(fā)酵型革蘭陰性桿菌菌種。
5.麥康凱平板：篩選革蘭陰性桿菌和非發(fā)酵菌。
6.SS瓊脂：篩選腸道致病菌，如志賀菌和沙門菌。
7.堿性瓊脂或TCBS瓊脂：從糞便中分離霍亂弧菌及其他弧菌。
8.血液增菌培養(yǎng)基：用于從血液、骨髓中分離常見病原菌。
第九章 細(xì)菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)
一、基本條件
(一)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室：生物安全柜。
(二)無菌實(shí)驗(yàn)室
(三)基本設(shè)備和器具：溫箱、CO2培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)設(shè)備;顯微鏡;高壓蒸汽滅菌器、干烤箱;接種環(huán)和接種針;火焰燈或酒精燈;平皿、試管、吸管等玻璃器皿，以及離心機(jī)、天平等。
二、常用的接種方法
(一)平板劃線接種法 用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。將標(biāo)本劃線接種到固體培養(yǎng)基表面，由于劃線的作用使細(xì)菌分散開，培養(yǎng)后單個(gè)：繁殖成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落。
1、分區(qū)劃線法：此法用于含菌量多的標(biāo)本的分離培養(yǎng)。
2.連續(xù)劃線法：此法用于含菌量少的標(biāo)本的分離培養(yǎng)。
(二)、斜面接種法主要用于純培養(yǎng)、保存菌種或生化反應(yīng)所用的斜面培養(yǎng)基的接種
(三)穿刺接種法主要月主要用于觀察動(dòng)力的半固體培養(yǎng)基或生化反應(yīng)所用的高層斜面培養(yǎng)基(雙糖鐵培養(yǎng)基)。
(四)液體接種法多用于增菌培養(yǎng)基(肉湯)或生化反應(yīng)所用的液體培養(yǎng)基的接種。
(五)傾注平板法用于尿液、牛乳和飲水等標(biāo)本細(xì)菌計(jì)數(shù)。將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，再傾入已溶化并冷卻至45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。
(六)涂布接種法多用于藥敏試驗(yàn)。也可用于被檢標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。
細(xì)菌的培養(yǎng)方法
根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌的目的和細(xì)菌類型選擇合適的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法等三種。
三、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：
(一)液體培養(yǎng)基：均勻渾濁;菌膜;絮狀沉淀。
(二)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象
1.菌落 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，由單個(gè)細(xì)菌繁殖形成的肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)稱為菌落。
2、菌落的特性包括大小、形狀、顏色、氣味、透明度、光滑度、濕潤度、黏度、邊緣和溶血性等。
根據(jù)表面光滑度的不同，細(xì)菌的菌落大體分為三型：
⑴光滑型菌落(S型菌落)新分離的細(xì)菌大多為光滑型菌落。
⑵粗糙型菌落(R型菌落)如結(jié)核分枝桿菌和炭疽芽胞。
⑶黏液型菌落(M型菌落)如肺炎克雷伯菌。
細(xì)菌在血瓊脂平板上生長可出現(xiàn)不同的溶血現(xiàn)象。
α溶血：菌落周圍出現(xiàn)1-2mm的草綠色溶血環(huán)，紅細(xì)胞外形完整無缺。
β溶血：紅細(xì)胞的溶解在菌落周圍形成完全清晰透明的環(huán)。
γ溶血(即不溶血)：菌落周圍無溶血環(huán)。
雙環(huán)：在菌落周圍完全溶解的暈圈外有一個(gè)部分溶血的第二個(gè)圓圈。
(三)、半固體培養(yǎng)基：穿刺線及菌的擴(kuò)散。
四、細(xì)菌L型的檢查
細(xì)菌L型的生物學(xué)性狀有其自身的特點(diǎn)，如形態(tài)多形性、染色不穩(wěn)定性以及生化反應(yīng)減弱等，檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)予注意，以防止工作中的漏診。
1、標(biāo)本采集應(yīng)盡量采集無雜菌污染的組織或體液標(biāo)本。胸水、腹水及尿液標(biāo)本，應(yīng)加20%蔗糖無菌溶液，以保持高滲;血液標(biāo)本應(yīng)接種高滲肉湯增菌培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)方法
(1)檢查程序：將標(biāo)本接種到高滲肉湯增菌培養(yǎng)1-7天，然后轉(zhuǎn)種于型平板和平板37℃培養(yǎng)2-7天。
血L型菌在型瓊脂平板上典型菌落為“荷包蛋”樣，但從患者標(biāo)本中新分離的L型菌落常不典型，多呈顆粒型菌落，涂片染色為多形性。
加第一章 外界因素對(duì)細(xì)菌的影響
第一節(jié) 基本概念
一、消毒：殺死物體上的病原微生物。
二、滅菌：殺死物體上所有微生物(病原性、非病原性、繁殖體、芽胞)
三、無菌及無菌操作：無菌(指物體上不含活菌)，無菌操作：(防止微生物進(jìn)入機(jī)體或其他物品的操作稱無菌操作)
四、防腐和抑菌：防止和抑制細(xì)菌物長繁殖的方法。
第二節(jié) 物理消毒滅菌法
一、熱力滅菌法：
(一) 高溫
1、干熱法：焚燒與燒灼(常用于接種環(huán)、接種針、瓶口和試管口)
干烤(160～170℃維持2h，常用于一般玻璃器皿、注射器、瓷器。)
2、濕熱法(優(yōu)點(diǎn)：易凝固蛋白;穿透力強(qiáng);有潛熱。)
方法：⑴高壓蒸汽滅菌法：最有效的濕熱滅菌法;121.3℃，維持15-20min可殺滅所有細(xì)菌芽胞和繁殖體，適用于耐高溫、耐濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料等。
⑵ 煮沸法：如水中加入2%碳酸鈉，則可提高沸點(diǎn)至105℃，既殺死芽胞，又防止金屬器皿生銹。
⑶流通蒸汽滅菌法：
⑷間歇滅菌法：
⑸巴氏消毒法：用于牛奶和酒類的消毒。
(二)低溫在低溫條件下，細(xì)菌代謝活動(dòng)降低不再繁殖，能較長時(shí)間維持生命，故常用于保存菌種。冷凍真空干燥是目前保存菌種的最好方法。
二、電磁波滅菌法：機(jī)理：干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制而殺菌;特點(diǎn)：穿透力弱，可損傷皮膚、眼睛;適用于空氣及物體表面的除菌。
1、日光及紫外線 紫外線在波長265- 266nm時(shí)殺菌作用最強(qiáng)。
2、電離輻射
三、濾過除菌法： 濾過是以物理阻留方法將液體或空氣中的微生物除去。矽
器。過濾法用于不耐高溫物品滅菌。用于除菌的濾膜孔徑為0.22μm。
但除不去L型細(xì)菌、支原體、衣原體和病毒;適用于空氣、抗血清和生物制品的除菌。
第三節(jié) 化學(xué)消毒滅菌法
一、消毒劑的殺菌機(jī)制：消毒劑常用于人體體表、醫(yī)療器具、排泄物及周圍環(huán)境的消毒。殺菌機(jī)制多樣，主要有：使菌體蛋白凝固變性或干擾DNA的復(fù)制;干擾微生物酶系統(tǒng)并影響其代謝;損傷細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性。
二、影響消毒效果的因素：
(1)消毒劑的性質(zhì)、濃度和作用時(shí)間：如表面活性劑對(duì)革蘭陽性菌的殺菌效果要強(qiáng)于革蘭陰性菌。
(2)微生物的種類與狀態(tài)
(3)溫度與酸堿度
(4)環(huán)境中有機(jī)物質(zhì)的存在
加第二章 細(xì)菌的感染與免疫
感染：一定條件下，細(xì)菌侵入機(jī)體后與機(jī)體的防御功能相互作用所引起的不同程度的病理變化過程。
病原菌與非病原菌。
第一節(jié) 正常菌群與條件致病菌
一、正常菌群
細(xì)菌在自然界的分布：
細(xì)菌在正常人體的分布：
(1)正常菌群定義：正常人體的體表及與外界相通的腔道粘膜上存在一定種類和數(shù)量的細(xì)菌，免疫功能正常時(shí)通常對(duì)人體無害。
(2)生理學(xué)意義：促進(jìn)消化;生物拮抗;營養(yǎng)作用;免疫作用;抑瘤作用;生長與衰老。
二、條件致病菌：
特定的致病條件：寄居部位的改變;機(jī)體免疫功能低;菌群失調(diào)。
第二節(jié) 細(xì)菌的致病性
致病性概念：細(xì)菌的致病性是指細(xì)菌引起疾病的能力，不同的病原菌對(duì)機(jī)體可引起不同的疾病。
病原菌的致病作用，與其毒力強(qiáng)弱、進(jìn)人機(jī)體的數(shù)量，以及侵入部位是否合適有密切的關(guān)系。
一、細(xì)菌的致病因素
(一)、細(xì)菌的毒力：
1、侵襲力：病原菌突破宿主防御機(jī)能，在體內(nèi)定居、繁殖、擴(kuò)散的能力。主要包括侵襲性酶類和菌體表面結(jié)構(gòu)。
2、毒素
外毒素:
(1)來源及化學(xué)組成：G 菌及部分G-菌生長繁殖過程中分泌出的蛋白質(zhì)。
(2)外毒素的主要特性有：①化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定：易被熱、酸及蛋白酶破壞，②免疫原性強(qiáng)：可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，稱為抗毒素。外毒素經(jīng)地。4%甲醛處理后脫去毒性仍保留免疫原性，稱為類毒素。。③毒性強(qiáng)，且有組織選擇性。
內(nèi)毒素:
(1)來源及化學(xué)組成：G-菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)。LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)：特異性多糖、非特異性核心多糖、脂質(zhì)A
(2)內(nèi)毒素的主要特性有：①化學(xué)成分是脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定：②免疫原性弱：刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力弱，不能被甲醛脫去毒性成為類毒素。③毒性弱，且無組織選擇性：
(3)內(nèi)毒素的生物學(xué)作用有：①發(fā)熱反應(yīng)。②白細(xì)胞反.③內(nèi)毒素休克。④DIC。
二、細(xì)菌的數(shù)量：一般是病原體毒力愈強(qiáng)，引起感染所需的病原體量愈小;反之則愈大。
三、細(xì)菌的入侵門戶：
第三節(jié) 抗細(xì)菌免疫機(jī)制
一、天然免疫(非特異性免疫) 非特異性免疫是個(gè)體生來具有的天然防御機(jī)能。
特點(diǎn)：機(jī)體抗菌免疫的第一道防線，發(fā)揮作用快，但無特異性，也不因病原菌的再次刺激而增強(qiáng)。
組成：
(1)屏障結(jié)構(gòu)：包括物理屏障-皮膚黏膜、血腦、胎盤屏障，作用：機(jī)械性阻擋、分泌殺菌物質(zhì)?；瘜W(xué)屏障-補(bǔ)體、溶菌酶、乙型溶素、防御素、正常菌群拮抗。
(2)吞噬細(xì)胞：包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。
二、獲得性免疫(特異性免疫)
特點(diǎn)：明顯的特異性和記憶性，可因可因再次接受相同抗原刺激而使免疫效應(yīng)增強(qiáng)。
組成：黏膜免疫系統(tǒng)、細(xì)胞免疫、體液免疫。
微生物感染的主要免疫類型：
(1)胞外菌感染：以中性粒細(xì)胞的吞噬、補(bǔ)體的調(diào)理溶菌及特異性抗體為主。
(2)胞內(nèi)菌的感染：以細(xì)胞免疫為主。
(3)外毒素的感染：以特異性抗毒素的中和作用為主。
第四節(jié) 感染的發(fā)生與發(fā)展
一、感染的來源： 內(nèi)源性 ;外源性
二、感染的方式與途徑：呼吸道、消化道、接觸、節(jié)肢動(dòng)物為媒介及創(chuàng)傷感染。
三、感染的類型：
1、感染的類型：隱性感染;顯性感染;帶菌狀態(tài)。
2、顯性感染按病情緩急分為：急性感染(突然發(fā)作，病程較短，一般是數(shù)日至數(shù)周。)慢性感染(病程較長，常持續(xù)數(shù)月至數(shù)年。)
3、 按感染部位分為
(1)局部感染、
(2)全身感染：(病原體或其毒性代謝產(chǎn)物向全身播散引起全身性癥狀的一種感染類型。)
毒血癥：是病原菌在入侵的局部組織生長繁殖，僅其產(chǎn)生的毒素進(jìn)入血流。
菌血癥：是病原菌由原發(fā)部位一時(shí)性或間歇性侵入血流，但不在血流中繁殖。
敗血癥：是病原菌侵入血流、大量繁殖并產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物。
膿毒血癥：指化膿性病原菌侵入血流后，在其中大量繁殖，并通過血流擴(kuò)散至機(jī)體的其他組織或器官，引起新的化膿性病灶。
第十章 細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)
一、碳水化合物的代謝試驗(yàn)
1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)：
接種的細(xì)菌，若能分解培養(yǎng)基中的糖(醇、苷)類產(chǎn)酸時(shí)，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中導(dǎo)管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。若不分解，培養(yǎng)基中除有細(xì)菌生長外，無任何其他變化。
鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)。
2.氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O/F試驗(yàn))：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。
3.β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))：遲緩發(fā)酵乳糖菌株的鑒定。
碳水化合物的代謝試驗(yàn)
4.七葉苷水解試驗(yàn)：D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。也可用于革蘭陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。
5.甲基紅試驗(yàn)：鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。
6.V-P試驗(yàn)：常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢邽殛栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。
二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)
其理為不同種類的細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的能力不同。細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解，一般先由胞外酶將復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為短肽(或氨基酸)，滲入菌體內(nèi)，然后再由胞內(nèi)酶將肽類分解為氨基酸。
1.明膠液化試驗(yàn)
某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解成氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。
應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。
2.吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)
某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成引噪(靛基質(zhì))，當(dāng)加入吲哚試劑(對(duì)位二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。
應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。
3.硫化氫試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗(yàn)可間接檢測細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。
應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。
4.尿素分解試驗(yàn)
原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。
應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。
5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)
某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酸痛，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。
應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。
6.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)
具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。
應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。
三、碳源和氮源利用試驗(yàn)
1.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)：腸桿菌科中菌屬間的鑒定。
2.丙二酸鹽利用試驗(yàn)：腸桿菌科中屬間及種的鑒別。
四、各種酶類試驗(yàn)
1.氧化酶試驗(yàn)：腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。
2.過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))：革蘭陽性球菌初步分群。
3.硝酸鹽還原試驗(yàn)：細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。
4.脂酶試驗(yàn)：厭氧菌的鑒別。
5.卵磷脂酶試驗(yàn)：厭氧菌的鑒定。
6.DNA酶試驗(yàn)：革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。
7.凝固酶試驗(yàn)：葡萄球菌鑒別。
8.CAMP試驗(yàn)：鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽性。
9.膽汁溶菌試驗(yàn)：肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒別。
五、抑菌試驗(yàn)
1.O/129抑菌試驗(yàn)：弧菌科的屬間鑒別。
2.桿菌肽試驗(yàn)：A群鏈球菌與非A群鏈球菌的鑒別。
3.奧普托欣試驗(yàn)：肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。
第十一章 細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法
一、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——免疫學(xué)檢測
二、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——分子生物檢測
(一)核酸雜交
(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
(三)生物芯片技術(shù)
三、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——細(xì)菌毒素檢測
·內(nèi)毒素檢測：檢測革蘭陰性細(xì)菌感染。
常用鱟試驗(yàn)。
·外毒素檢測：檢測革蘭陽性菌及部分陰性菌感染。
體內(nèi)及體外毒力試驗(yàn)檢測。
四、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)
·主要用途：分離和鑒定病原微生物;測定細(xì)菌的毒力;制備免疫血清;建立致病動(dòng)物模型;動(dòng)物的血液是配制細(xì)菌培養(yǎng)基的必需材料;用于生物制品或一些藥物的安全、毒性、療效檢驗(yàn)。
·實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠、豚鼠、家兔及綿羊等。
·接種方法：皮下/皮內(nèi)/肌內(nèi)/腹腔/靜脈/腦內(nèi)注射等。
1.標(biāo)本的采集和處理原則
(1)標(biāo)本采集的一般原則
(2)標(biāo)本的處理
2.細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查
(1)不染色標(biāo)本
(2)染色標(biāo)本
3.細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定
(1)培養(yǎng)基的種類和選擇
(2)分離培養(yǎng)
(3)生化反應(yīng)
(4)鑒定
4.細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法
(1)免疫學(xué)檢測
(2)分子生物學(xué)檢測
(3)細(xì)菌毒素檢測
(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
第十二章 微生物自動(dòng)化檢測
一、微生物自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)
1、自動(dòng)血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)
原理：檢測細(xì)菌和真菌生長時(shí)所釋放的二氧化碳來作為血液中有無微生物存在的指標(biāo)。
檢測技術(shù)：放射標(biāo)記、顏色變化(CO2感受器)、熒光技術(shù)和壓力檢測等。
適用：血培養(yǎng)，其他無菌部位標(biāo)本如腦脊液、胸水、腹水和關(guān)節(jié)液等。
儀器的基本結(jié)構(gòu)包括：①主機(jī)，恒溫孵育系統(tǒng)(全自動(dòng))、檢測系統(tǒng);②計(jì)算機(jī)及其外圍設(shè)備;③培養(yǎng)瓶;④抗凝劑和吸附劑。
影響因素：正確使用和定期維護(hù);采血次數(shù);采血時(shí)間;采血量;采血方法;及時(shí)送檢;終末傳代。
2、自動(dòng)分枝桿菌檢測系統(tǒng)
原理：檢測分枝桿菌生長時(shí)所釋放的C02或者所消耗的02作為標(biāo)本中有無微生物存在的指示。
檢測技術(shù)：放射標(biāo)記、顏色變化、熒光技術(shù)等。
二、微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的原理
1、微生物數(shù)碼分類鑒定技術(shù)
基本原理：計(jì)算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個(gè)細(xì)菌條目對(duì)系統(tǒng)中每個(gè)生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和。
(1)數(shù)據(jù)庫：已知臨床相關(guān)菌株按照對(duì)各種生化反應(yīng)的出現(xiàn)頻率事先編碼建立數(shù)據(jù)庫。
(2)數(shù)碼鑒定：計(jì)算未知菌對(duì)5種反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。
(3)編碼：對(duì)未知菌編碼。
(4)查碼。
2、微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)與性能
全自動(dòng)微生物鑒定儀的主要結(jié)構(gòu)：
·充液/封口部件：標(biāo)本注入。
·讀數(shù)儀/孵箱：讀取樣本生長變化。
·計(jì)算機(jī)：分析資料儲(chǔ)存。
·鍵盤：輸入操作指令。
·打印機(jī)：顯示打印結(jié)果。
3、微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的工作流程及操作要點(diǎn)
(1)菌種準(zhǔn)備：標(biāo)本處理，預(yù)實(shí)驗(yàn)和菌落的選擇。
(2)接種：制備細(xì)菌懸液，接種。
(3)觀察及記錄結(jié)果。
(4)結(jié)果解釋。
三、自動(dòng)藥敏檢測系統(tǒng)
1、微量稀釋法試驗(yàn)系統(tǒng)
目前應(yīng)用最多的系統(tǒng)。
分類：計(jì)算機(jī)輔助手工系統(tǒng)、半自動(dòng)系統(tǒng)、全自動(dòng)系統(tǒng)。
原理：肉湯稀釋法;常采用比濁法檢測液體培養(yǎng)基中細(xì)菌生長。
結(jié)果：在抗菌藥物存在的情況下，濁度降低是細(xì)菌生長受抗菌藥物抑制的表現(xiàn)，而濁度增加表明細(xì)菌耐藥。
2、紙片擴(kuò)散法閱讀系統(tǒng)
根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，閱讀平板抑菌圈及解釋結(jié)果。
系統(tǒng)掃描平板，通過圖形分析，5s內(nèi)確定抑菌圈直徑，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)化為敏感性結(jié)果(敏感、耐藥、中介)。
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