解螺旋公眾號(hào)·陪伴你科研的第1777天
對(duì)于乳腺癌來(lái)說(shuō)，MALAT1到底是抑制了轉(zhuǎn)移還是促進(jìn)了轉(zhuǎn)移呢？
今天就以發(fā)表在Nature Genetics這篇“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”文章為切入點(diǎn)，說(shuō)的是lncRNA MALAT1抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，問(wèn)題是大部分文章是說(shuō)MALAT1促進(jìn)乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移。
到底哪里出問(wèn)題了呢? 之所以會(huì)出現(xiàn)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的表型，是因?yàn)镸ALAT1這個(gè)基因的位置位于臨近基因（NEAT1，F(xiàn)RMD8）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，當(dāng)我們通過(guò)基因敲除的方法把這段MALAT1基因的序列敲掉后，不僅會(huì)敲除 MALAT1基因，其臨近基因的表達(dá)也會(huì)受到影響。
目前大多數(shù)的功能性研究都集中在使用siRNAs、shRNAs或者ASOs，這些RNAs只能干擾已經(jīng)生成的RNA轉(zhuǎn)錄本，不能有效的消耗lncRNA的靶標(biāo)，并且可能產(chǎn)生一些意想不到的后果。siRNAs/shRNAs主要在細(xì)胞質(zhì)中活化來(lái)介導(dǎo)RNAi，而lncRNA的靶標(biāo)通常在核里。
此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明siRNAs/shRNAs可通過(guò)轉(zhuǎn)錄基因沉默改變細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄。因此，使用siRNAs/shRNAs產(chǎn)生的功能性結(jié)果可以通過(guò)染色質(zhì)的表觀遺傳沉默和/或RNA聚合酶II活性的降低來(lái)間接介導(dǎo)，這種作用效果的不確定性增加了研究者對(duì)ASO介導(dǎo)方法的偏好。
現(xiàn)有研究表明，ASO是通過(guò)RNaseH依賴性機(jī)制引發(fā)細(xì)胞核中RNA的降解（如下圖所示），并且尚未有報(bào)道指出這種機(jī)制可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)前實(shí)驗(yàn)方法的局限性阻礙了lncRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用與lncRNA本身分子作用的全面分離。
為了阻斷轉(zhuǎn)錄，許多研究采用了RNA聚合酶II起始或延伸的抑制劑，但這些抑制劑往往也會(huì)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此它們?cè)诠δ苎芯恐械挠猛揪褪艿搅讼拗啤?/span>
目前，基于啟動(dòng)子缺失和插入轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的基因編輯技術(shù)，使用序列特異性核酸酶，如鋅指酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）或CRISPR/Cas9是非常有前景的研究lncRNA功能的方法。
前面提到的“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”中作者采用CRISPR方法在基因組上引入終止子（如下圖所示），從而可以更真實(shí)的反應(yīng)MALAT1本身的生物學(xué)功能。
而調(diào)節(jié)位點(diǎn)的deletion是不能夠區(qū)分是DNA序列的作用還是由該區(qū)域產(chǎn)生的lncRNA的作用。因此，在基因組上引入終止位點(diǎn)可能是研究lncRNA比較有前景的方法，而對(duì)于eRNA (Enhancer RNA)，其合成往往是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游終止，所以這種方法也不會(huì)改變大多數(shù)eRNA的產(chǎn)生。
近年來(lái)，CRISPR interference (CRISPRi) 和CRISPR activation (CRISPRa)基于核酸酶活性失活的Cas9 (dCas9)與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 (干擾或激活)融合，這項(xiàng)技術(shù)將為研究ncRNA提供更好的手段。此外，通過(guò)對(duì)RNA聚合酶II形成空間位阻，單獨(dú)使用dCas9而不與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合來(lái)實(shí)現(xiàn)的CRISPRi可以在不改變局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上來(lái)研究ncRNA轉(zhuǎn)錄的作用。
然而，盡管有很多工具可用，但是迄今為止尚未開發(fā)出用于阻止特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄而不影響該區(qū)域的其他特征的好方法?？傊?，為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們應(yīng)該使用多種不同的方法來(lái)進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)，做下游靶基因或者臨近基因的改變的話，需要通過(guò)Rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，以確保得到科學(xué)的結(jié)論。
下圖是對(duì)研究lncRNA所使用的策略總結(jié)，還有每種策略的局限性：
技術(shù)推動(dòng)科學(xué)的發(fā)展，在科學(xué)研究的道路上還需要我們不斷創(chuàng)新開發(fā)更好的工具來(lái)探索生命科學(xué)的奧秘，大家努力加油吧！
附：關(guān)于lncRNA敲減策略選擇
關(guān)于lncRNA干擾策略問(wèn)題，雖然siRNAs/shRNAs/ASO已經(jīng)成功地用于干擾特定的lncRNA，但每種方法對(duì)于不同的lncRNA起到的干擾效果可能會(huì)有所不同。首先要考慮的就是lncRNA的亞細(xì)胞定位。
如下Fig.1所示，針對(duì)于細(xì)胞核定位的兩種lncRNA (MALAT1和NEAT1)，使用ASO明顯比siRNA起到更好的抑制效果；針對(duì)于細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA (DANCR和OIP5-AS1)，如Fig.2所示，siRNA發(fā)揮出了明顯的優(yōu)勢(shì)；而對(duì)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都有定位的lncRNA (YUG1、CasC7、HOTAIR)，單獨(dú)使用siRNA或ASO都沒(méi)有前面兩種效果好(Fig.3)。
Fig.1
Fig.2
Fig.3
但是，聯(lián)合使用siRNA和ASO卻能達(dá)到很好的敲低效果，并且針對(duì)于單純細(xì)胞核定位或是細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA而言，ASO和siRNA一起使用都比單獨(dú)使用有更好的干擾效果（圖4）。有趣的是，對(duì)細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA采用ASO敲低可能比siRNA作用于細(xì)胞核定位的lncRNA更為有效(如圖5)提示我們細(xì)胞質(zhì)中RNaseH1的活性水平可能高于我們先前了解的水平。最近研究表明轉(zhuǎn)染ASO后，mRNA降解的限速步驟與RNaseH1的數(shù)量有關(guān)，進(jìn)一步表明了在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有RNaseH1活性。
Fig.4
Fig.5
總之，當(dāng)我們要干擾lncRNA時(shí)，首先考慮其定位，反義寡核苷酸ASO用于細(xì)胞核定位lncRNA，RNAi用于細(xì)胞質(zhì)定位lncRNA，當(dāng)lncRNA定位未知時(shí)，如果只用一種方法的話，優(yōu)先選用ASO敲低可能會(huì)更好，聯(lián)合使用ASO和RNAi往往會(huì)達(dá)到比單一方法更有效的敲低效果，這種聯(lián)合方法又特別適用用核質(zhì)雙定位的lncRNA。
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