在基因組開放性研究中，目前最強大最主流的技術(shù)是ATAC-seq。ATAC-seq（染色質(zhì)易開放區(qū)域測序）是利用Tn5轉(zhuǎn)座子酶對基因組的染色質(zhì)進行切割并引入測序接頭，然后構(gòu)建文庫，對基因組上的開放染色質(zhì)進行測序的一種技術(shù)。
ATAC-seq將表觀研究的本質(zhì)聚焦到染色質(zhì)的易接近性變化，是聯(lián)系復(fù)雜表觀/轉(zhuǎn)錄調(diào)控與轉(zhuǎn)錄組變化的關(guān)鍵點，可將表觀遺傳研究化繁為簡。目前，ATAC-seq是表觀研究的最新手段和高分文章的利器，文章數(shù)量以每年翻一倍的速度快速增長。在下文，我們會繼續(xù)介紹ATAC-seq技術(shù)的原理。
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在看完促銷信息，也許你會好奇ATAC-seq到底基于什么樣的原理，來實現(xiàn)基因組開放區(qū)的檢測。
首先，我們來看看進行基因組可接近性研究的方法都有哪些。所有檢測基因組開放區(qū)的方法，都是介于CHIP-seq和重測序之間的方法。這些方法的共同特點是：利用一定的方法，將與基因組開放區(qū)相關(guān)的DNA片段富集下來，然后利用芯片雜交或測序的方法，來檢測基因組開放區(qū)的位置并研究其特性。
一些富集方法的發(fā)明要早于二代測序技術(shù)，但直到與二代測序結(jié)合，才如虎添翼。圖1a羅列了各個基于二代測序的基因組開放性檢測方法代表性文章出現(xiàn)的時間。
考慮到發(fā)大文章需要時間，所以MNase-seq，DNAse-seq，F(xiàn)AIRE-seq基本是二代測序剛剛出現(xiàn)，大家就迫不及待地嘗試了。而最新的技術(shù)ATAC-seq直到2013年才出現(xiàn)，而它相比其他技術(shù)，有自己獨特的優(yōu)勢。下面我們逐一介紹這4種常見的技術(shù)。
圖1 幾種常見的基因組可接近性檢測的方法出現(xiàn)時間和效果示意圖
微球菌核酸酶（microccocal nuclease，MNase）是一種同時具有內(nèi)切和外切酶活性的核酸酶。因為兼顧具有內(nèi)外切酶的活性，MNase會逐漸一點一點咬下任何“裸露”的DNA，除非DNA被核小體或其他蛋白結(jié)合而得到保護。
即MNase只降解核小體連接區(qū)和開放區(qū)的DNA，而被蛋白保護的DNA不被降解。利用這一特性，只要將甲醛固定后的染色質(zhì)用MNase進行酶切處理，然后富集剩余的DNA片段, 這些DNA區(qū)域就是核小體包裹或者被轉(zhuǎn)錄因子綁定的區(qū)域(圖1b)。
從圖1b可以看出，MNase-seq主要用于研究核小體位置的技術(shù)，開放區(qū)的信號本身是缺失的（因為開放區(qū)的DNA已經(jīng)被完全降解而無法檢測）。所以，MNase-seq只能間接檢測染色質(zhì)開放區(qū)，并非基因組開放區(qū)檢測的最優(yōu)技術(shù)。
DNA酶I（DNase I）是我們熟悉的一種核酸內(nèi)切酶。同樣的，DNase I無法酶切被核小體或其他蛋白保護的DNA片段，而且DNase I優(yōu)先切割染色質(zhì)中的開放區(qū)。所以染色質(zhì)開放區(qū)通常也是DNase I超敏感位點（DNase I hypersensitive site，DHS）。
因為是核酸內(nèi)切酶，只要酶切條件控制得當(dāng)，DNase I不至將開放區(qū)的DNA完全切成單堿基狀態(tài)，而是只是將開放區(qū)的DNA酶切為片段，為后續(xù)的測序提供了可能。
簡單說來，DNase-seq就是利用DNase I優(yōu)先切割染色質(zhì)中開放區(qū)的特性，富集被切割下來的DNA片段進行測序，從而實現(xiàn)對基因組的開放區(qū)的檢測（圖1b）。該技術(shù)出現(xiàn)比較早，所以在人類ENCODE計劃中大量使用。
但該技術(shù)對細胞起始量的要求較高，一般細胞數(shù)量要達到1~10 Millions，實驗復(fù)雜（包括精確的細胞定量，酶濃度的控制等），并且實驗準(zhǔn)備時間較長，需要2-3天。
FAIRE-seq與DNase效果相似，但實驗更簡單。其大概實驗過程是，在甲醛固定核小體-DNA的結(jié)合關(guān)系后，用超聲波破碎染色質(zhì)，并用有機溶劑酚-氯仿抽提。酚氯仿抽提DNA后會使溶液分層，上層為水相，含有DNA（主要為裸露的DNA）；中間為蛋白（包含核小體-DNA復(fù)合物）。只要富集水相的DNA并進行測序，即可以獲得開放區(qū)的信息。
該技術(shù)最大的不足：1）DNA片段大小不易控制，因此開放區(qū)檢測精度較差；2）數(shù)據(jù)往往有較高的背景（非開放區(qū)DNA）噪音，導(dǎo)致數(shù)據(jù)可靠性下降。
ATAC-seq是最晚出現(xiàn)的技術(shù)，也是發(fā)展最為迅速的技術(shù)。ATAC-seq的全稱是Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing。首先簡要介紹一下轉(zhuǎn)座子(Transposon)。
轉(zhuǎn)座子在生物基因組中普遍存在，是可以不斷自我移動并插入基因組新的位置的“跳躍元件”。轉(zhuǎn)座子的移動，離不開其自身編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用。轉(zhuǎn)座酶基本作用機制：可以隨機結(jié)合并切割開放裸露的DNA，并在切割位點插入其自身攜帶的DNA序列。
利用轉(zhuǎn)座酶的這一特性，基因工程人員可以讓轉(zhuǎn)座酶攜帶上二代測序接頭。這樣轉(zhuǎn)座酶在切割基因組DNA時（相當(dāng)于隨機打斷DNA），不但切斷了DNA還自動加入了一段二代測序接頭，從而減少了文庫構(gòu)建的一個步驟，降低了文庫構(gòu)建所需的樣本起始量（圖2a）。
同時，和其他核酸酶類似，在切割染色質(zhì)DNA的時候，轉(zhuǎn)座酶主要切割基因組開放的區(qū)域。而核小體致密排列的閉合染色質(zhì)區(qū)，轉(zhuǎn)座酶是無法切割的（圖2b）。
轉(zhuǎn)座酶酶切后，對酶切片段DNA進行富集，就實現(xiàn)了對基因組開放區(qū)DNA的獲取。有一點不同的是，轉(zhuǎn)座酶也可以切割染色質(zhì)開放區(qū)附近的核小體間連接區(qū)的DNA，從而也可以得到核小體的印記信息。在這一點上說，ATAC-seq的結(jié)果與DNase-seq非常相似，同時具有部分MNase-seq的特性（圖1b）。
圖2 轉(zhuǎn)座酶用于ATAC-seq的原理
那么ATAC-seq技術(shù)最大的優(yōu)點是什么呢？有兩點:
1
建庫起始量低
因為ATAC-seq一步實現(xiàn)片段化基因組DNA和加入測序接頭，大大降低了樣本起始量要求。相比FAIRE-seq和DNase-seq的一百萬細胞起始量要求，ATAC-seq僅僅需要500個甚至更低的細胞量即可滿足建庫，對于稀有樣本的檢測是很好的優(yōu)勢。
2
樣本制備簡單
相比其他技術(shù)需要進行復(fù)雜的樣本準(zhǔn)備（例如甲醛固定）和精確的酶濃度定量，ATAC-seq建庫步驟更簡單快捷，從而減少了長時間操作導(dǎo)致的樣本不穩(wěn)定。
當(dāng)然，那怕是ATAC-seq也要經(jīng)歷復(fù)雜的細胞核提取過程，實驗難度依然較大。因此ATAC-seq的數(shù)據(jù)依然比較寶貴，其依然是發(fā)高分文章的利器。
圖3 三種基因組可接近性檢測技術(shù)的建庫要求比較
以上就是幾種基因組可接近性技術(shù)的介紹和比較。應(yīng)該說，理想條件下這幾種技術(shù)可以得出相似的結(jié)果。所以在一些大文章中，為了證明自己的數(shù)據(jù)可靠，作者也會同時陳列幾種技術(shù)檢測的結(jié)果。
如下圖，文章作者就是想呈現(xiàn)ATAC-seq和DNase-seq、FAIRE-seq的峰基本是一致的。同時，也可以看到，在500個細胞的條件下，ATAC-seq依然有非常優(yōu)異的表現(xiàn)。
圖4 幾種基因組可接近性檢測結(jié)果的比較（DOI:10.1038/NMETH.2688）
圖5 谷歌學(xué)術(shù)檢索“ATAC-seq”的文章數(shù)量
正因為ATAC-seq的這些優(yōu)點，從2013年面世以來，ATAC-seq相關(guān)的文章以幾乎每年增長一倍的數(shù)量快速增加。那么，ATAC-seq到底可以做哪些分析，如何吸引大家關(guān)注呢？請看我們后續(xù)的文章介紹ATAC-seq的文章應(yīng)用思路。
技術(shù)介紹完了，大家是否對ATAC-seq有了更深的期待了呢？那么，可以回到文章開頭，掃二維碼參與ATAC-seq免費活動吧。
