原創(chuàng) 2017-10-11 訂閱號(hào)APExBIO
近日，來自法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)， TYRP1 mRNA，除了編碼TYRP1，還可以有效地扣留（sequestering）miR-16。miR-16被扣留后不能夠抑制其mRNA靶標(biāo)，例如RAB17 mRNA。由于RAB17促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤生長，因此miR-16無法再發(fā)揮腫瘤抑制活性。通過沉默TYRP1或增加miR-16的表達(dá)，可以在體外恢復(fù)miR-16的腫瘤抑制功能。重要的是，利用小寡核苷酸掩蔽TYRP1 mRNA上的miR-16結(jié)合位點(diǎn)也可以阻礙TYRP1對(duì)miR-16的扣留。miRNA異位成為黑色素瘤新的靶向治療方向。該結(jié)果發(fā)表于《Nature Cell Biology》。
MicroRNA（miRNA）是一類小的（?22個(gè)核苷酸）的非編碼RNA，在許多生物過程和疾病中起關(guān)鍵作用，包括瘤形成。
miRNA指導(dǎo)沉默Argonaute蛋白復(fù)合體到信使RNA靶標(biāo)以引發(fā)轉(zhuǎn)錄后抑制。當(dāng)編碼蛋白質(zhì)的基因在細(xì)胞內(nèi)處于活性狀態(tài)時(shí)，其信息會(huì)從DNA形式轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)。如果一切順利，這些編碼的mRNA信號(hào)會(huì)通向細(xì)胞的蛋白質(zhì)制造工廠，在那里用它作為模板合成新的蛋白質(zhì)。miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNA來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
圖1▲ 來源于網(wǎng)絡(luò)
miRNA種子序列（核苷酸2至7）與mRNA的miRNA反應(yīng)元件（MREs，miRNA response elements）之間的完美堿基配對(duì)可抑制mRNA翻譯并介導(dǎo)mRNA衰減。不完美的種子配對(duì)也是有效的。除了導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后抑制的這些miRNA-mRNA相互作用之外，很多研究已經(jīng)鑒定了大量非典型結(jié)合位點(diǎn)，這里稱為非典型MREs。最近有兩個(gè)meta分析證實(shí)非典型MREs可以與miRNAs有效地相互作用。第一項(xiàng)研究認(rèn)為這些非典型結(jié)合位點(diǎn)是“非功能性的”，因?yàn)樗鼈儾唤閷?dǎo)mRNA衰減并且沒有序列保守性的表現(xiàn)，第二個(gè)研究鑒定了幾種不同類型的非典型結(jié)合位點(diǎn)可以下調(diào)mRNA表達(dá)。
開發(fā)用于研究體外和體內(nèi)特異性miRNA生物學(xué)功能的常見方法之一是利用稱為miRNA海綿（miRNA sponge）的人造外源DNA構(gòu)建體。miRNA海綿含多個(gè)靶miRNA結(jié)合位點(diǎn)，從而特異性抑制靶miRNA并去抑制靶miRNA的RNA靶標(biāo)。也就是miRNA海綿吸滿了miRNA，這樣miRNA就無法與其天然靶點(diǎn)結(jié)合。因此，miRNA海綿是有效的miRNA抑制劑。最近，有研究描述了一些內(nèi)源性miRNA海綿，包括環(huán)狀RNA。類似地，循環(huán)RNA包含數(shù)十種單個(gè)miRNA的典型MREs，并且顯示出對(duì)miRNA介導(dǎo)的RNA衰變的抗性。
RNAs對(duì) miRNA的扣留可能具有重要的生理和病理功能。然而，這些RNAs競爭者包括天然miRNA海綿和非規(guī)范MREs仍然很大程度上是未知的。
作者之前證實(shí)，轉(zhuǎn)移性黑素瘤（melanoma）活檢中酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1， tyrosinase-related protein 1）的mRNA表達(dá)升高與患者的總體生存期差相關(guān)聯(lián)。也證實(shí)，單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs683，位于TYRP1 3’非翻譯區(qū)（3’UTR）上的一個(gè)MRE-155中，強(qiáng)烈地減少miR-155誘導(dǎo)的衰減，從而導(dǎo)致TYRP1 mRNA水平的升高。然而，TYRP1 mRNA與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者生存的分子機(jī)制仍然是未知的。
在這里，作者發(fā)現(xiàn)高水平的TYRP1 mRNA促進(jìn)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的生長。使用小發(fā)夾RNA（shRNA）或短干擾RNA（siRNA）來沉默（KD）TYRP1 mRNA，均阻礙了501Mel，ME1402和Mel624等黑素瘤細(xì)胞的增殖。同樣，沉默TYRP1 mRNA顯著抑制小鼠腫瘤的生長。在這些實(shí)驗(yàn)條件下無法檢測到TYRP1蛋白，細(xì)胞增殖和腫瘤生長與TYRP1蛋白的水平無關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，TYRP1 mRNA除了行使蛋白質(zhì)編碼功能，還可能發(fā)揮非編碼生物學(xué)功能。
那么TYRP1 mRNA是否可以作為天然的miRNA海綿來遏制miRNA的腫瘤抑制活性呢？
為了鑒定TYRP1相關(guān)的miRNAs，作者將TYRP1的3’UTR用作RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的誘餌。使用TaqMan低密度陣列（800個(gè)miRNAs）純化和定量免疫沉淀的miRNAs。發(fā)現(xiàn)兩種miRNA（miR-155和miR-16）顯著富集，獨(dú)立于表達(dá)水平。TargetScan，一種根據(jù)miRNA種子區(qū)域及其靶標(biāo)之間的完美序列匹配來預(yù)測miRNA靶標(biāo)的計(jì)算方法，無法在TYRP1上檢測到MRE-16。相比之下，基于熱力學(xué)的RNA雜交算法，鑒定了三個(gè)推定的MRE-16以及先前驗(yàn)證的三個(gè)MRE-155。
圖2▲ 三個(gè)MRE-16
鑒定的MRE-16沒有顯示針對(duì)典型miR-16靶標(biāo)的前排GCUGCU基序（motif），表明存在非典型堿基配對(duì)。在合成miR-16的存在下，TYRP1 mRNA水平增加了，而miR-155的存在誘導(dǎo)了TYRP1 mRNA的衰減。同時(shí)，合成的miR-16增加了嵌合miRNA傳感器的熒光素酶活性，傳感器含有與熒光素酶編碼序列融合的TYRP1非典型MRE-16序列。這些結(jié)果表明，盡管miR-16與TYRP1 mRNA相互作用，但是miR-16不誘導(dǎo)TYRP1 mRNA的衰減。miR-16是腫瘤抑制miRNA，作者假設(shè)TYRP1 mRNA的高表達(dá)水平可以扣留miR-16以限制其腫瘤抑制活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默TYRP1導(dǎo)致顯著的細(xì)胞密度降低，這種作用是miR-16依賴性的，可通過轉(zhuǎn)染miR-16抑制劑來逆轉(zhuǎn)。合成的miR-16可有效降低小鼠黑素瘤細(xì)胞的增殖。這些數(shù)據(jù)表明TYRP1 mRNA是有效的miR-16海綿。
圖3▲ TYRP1 mRNA是有效的miR-16海綿
miRNA海綿“吸取”特異性miRNA的功效不僅取決于miRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和親和力，還取決于海綿吸取miRNA水平的豐度。鑒于每個(gè)TYRP1 mRNA分子顯示三個(gè)非典型MRE-16，整個(gè)miR-16池可以潛在地被每個(gè)細(xì)胞扣留。在等摩爾水平下，合成的miR-16消除了miR-155誘導(dǎo)的TYRP1 mRNA的衰變。重要的是，在黑素瘤活組織檢查中，miR-16以比miR-155更高的水平表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明內(nèi)源性miR-16否定了miR-155對(duì)TYRP1-A（A等位基因）的作用。因此，黑素瘤中TYRP1的表達(dá)水平及其相關(guān)的miRNA海綿活性與SNP rs683和miR-16的水平密切相關(guān)。
腫瘤抑制因子miR-16是若干調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的下游靶標(biāo)如RAB17和NRTN的上游調(diào)節(jié)因子。miR-16的異位表達(dá)顯著降低RAB17，MAFF和NRTN的表達(dá)。重要的是，在191例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤樣本中，RAB17水平與TYRP1水平呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RAB17的沉默顯著降低免疫受損小鼠中移植腫瘤的生長。
作者用稱為靶位點(diǎn)阻斷劑（TSB）的小反義寡核苷酸來阻止TYRP1結(jié)合miR-16。TSB-T3增加了miR-16活性，并降低了兩種黑素瘤細(xì)胞系中RAB17的水平和細(xì)胞密度。TSB-T3處理的小鼠的腫瘤體積顯著減小。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，TSB-T3掩蓋了TYRP1上的MRE-16，并將miR-16重定向到RAB17 mRNA。
圖4▲ TSB-T3掩蓋了TYRP1上的MRE-16
圖5▲ 恢復(fù)miR-16活性后抑制腫瘤生長
總之， TYRP1 mRNA通過扣留miR-16并抑制其腫瘤抑制活性而在黑素瘤中表現(xiàn)出非編碼功能?？哿舻膍iR-16不再能夠抑制其參與細(xì)胞增殖和腫瘤生長的靶標(biāo)。因此得出結(jié)論，TYRP1通過扣留miR-16間接地調(diào)節(jié)黑素瘤的生長。TYRP1 mRNA作為一個(gè)強(qiáng)有力的miR-16海綿，具有三個(gè)屬性：首先，TYRP1在大多數(shù)黑素瘤中高表達(dá)；其次，SNP rs683決定了TYRP1 miRNA海綿的活性。第三，非典型的miR-16結(jié)合位點(diǎn)扣留miR-16。該發(fā)現(xiàn)也為通過使用TSB作為創(chuàng)新治療分子創(chuàng)造了更多的機(jī)會(huì)。
原始論文：
A non-coding function of TYRP1 mRNA promotes melanoma growth.
Nature Cell Biology. Published online 9 October 2017.
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