聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能最強(qiáng)大的技術(shù)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是在標(biāo)準(zhǔn) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成，常用于定量樣本中的 DNA 或RNA。
利用熒光探針或熒光 DNA 結(jié)合染料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應(yīng)所需的熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。利用序列特異性引物，可測定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷貝數(shù)。通過檢測 PCR 循環(huán)的每個(gè)階段中擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)定量。如果樣本中存在高豐度的特定序列 (DNA 或 RNA)，則在早期循環(huán)中即可觀察到擴(kuò)增；如果序列較少，則在晚期循環(huán)中方可觀察到擴(kuò)增。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，常見困難可歸結(jié)為六個(gè)主要方面，今天重點(diǎn)介紹前三種：
一、引物二聚體的形成
1、引物二聚體形成的原因
引物二聚體的形成是在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 設(shè)計(jì)和驗(yàn)證過程中最常見的問題之一，當(dāng)引物對之間的部分序列存在同源性時(shí)，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應(yīng)過程中引物退火形成二聚體，則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長于原始引物的產(chǎn)物，它可導(dǎo)致循環(huán)過程中更易出現(xiàn)退火錯誤。根據(jù)長度的不同，引物也可能出現(xiàn)自身折疊，由此與模板形成沖突。反應(yīng)的復(fù)雜性 (尤其在多重反應(yīng)過程中) 可使上述不良影響發(fā)生的幾率增加。
2、如何確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。如圖 1所示，引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨(dú)采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗(yàn)證的缺點(diǎn)在于，其靈敏度最低僅達(dá)到納克級，因此可能無法得出結(jié)果。凝膠電泳分析的優(yōu)勢是當(dāng)解離曲線 (熔解曲線) 數(shù)據(jù)同時(shí)可用時(shí)，產(chǎn)物的大小有助于對結(jié)果進(jìn)行綜合解釋。
解離曲線，又稱熔解曲線，是利用雙鏈 DNA 結(jié)合染料獲得的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)熱廊線。如果擴(kuò)增具有極好的特異性，則實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 板上每個(gè)反應(yīng)孔的解離曲線將出現(xiàn)一個(gè)較窄的單峰。引物二聚體的熒光強(qiáng)度較低，呈較寬的“波形”，顯示其在 70°C 左右熔解。出現(xiàn)此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問，可將觀察的結(jié)果與 NTC（No Template Control，即無模板對照，是陰性對照）反應(yīng)孔相比較，當(dāng)模板不存在時(shí)，更易出現(xiàn)引物二聚體峰 (圖 2，熔解曲線中突出顯示了特異性擴(kuò)增 (圖2A) 和引物二聚體效應(yīng)(圖2B)?？衫?NTC 樣本在熔解曲線中產(chǎn)生多余的峰(圖2B) 識別出引物二聚體)。
3、如何減少或去除引物二聚體？
如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。
（1） 首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán) (由 95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。
（2）可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
（3）鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。
（4）如果未對引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評估，則應(yīng)補(bǔ)充評估并考慮重新設(shè)計(jì) (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。
（5）在理論上，針對同一靶點(diǎn)應(yīng)同時(shí)檢測多個(gè)引物組。這實(shí)際上可以節(jié)省大量時(shí)間，因?yàn)槿绻@些引物中的一個(gè)能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費(fèi)在優(yōu)化過程上的時(shí)間。
二、引物和探針的儲存
1、引物和探針的儲存
盡管引物和探針的儲存經(jīng)常被忽略，但其在保證實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩(wěn)定性的主要因素是儲存溫度、儲存時(shí)間、是否被長時(shí)間暴光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。圖3擴(kuò)增曲線分別顯示了儲存不當(dāng)?shù)囊?(A) 與儲存適當(dāng)?shù)囊?(B) 產(chǎn)生的效果。
圖3
2、長期保持引物和探針的穩(wěn)定性保持引物和探針的穩(wěn)定性的關(guān)鍵有四點(diǎn)：
（1）低壓凍干的引物在儲存時(shí)間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應(yīng)置于 -20°C 保存，且若保存時(shí)間超過一年則應(yīng)對其進(jìn)行監(jiān)測，看它是否出現(xiàn)功能下降。
（2）對于標(biāo)記的引物和探針，則應(yīng)采取措施避免標(biāo)記物暴光 (例如使用不透明管及置于暗處保存)，以延長它們的使用壽命。
（3）引物濃度也可影響其穩(wěn)定性。建議引物的儲存濃度不低于10 μM；實(shí)際上，在大多數(shù)情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應(yīng)分裝保存，以減少凍融次數(shù)，特別是標(biāo)記的引物和探針。
（4）最后，TE 緩沖液可形成比水更為穩(wěn)定的環(huán)境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩沖液 (標(biāo)準(zhǔn) TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液，這是由于一些 PCR 反應(yīng)對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。
三、NTC 擴(kuò)增
如前所述，當(dāng)引物二聚體形成時(shí)，如果使用與 DNA 雙鏈結(jié)合的染料，在 NTC 反應(yīng)中也可觀察到熒光信號。無論是基于探針還是雙鏈 DNA 結(jié)合染料的反應(yīng)，在存在污染物的情況下，也可看到晚期擴(kuò)增。見圖4，A是擴(kuò)增曲線B是溶解曲線。
如果在每一個(gè) NTC 反應(yīng)里都出現(xiàn)擴(kuò)增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了?？刹捎靡韵虏襟E防止或去除污染。
（1）使用干凈的工作臺，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作臺面。
（2） 用帶 dUTP 和 UDG 的反應(yīng)預(yù)混液降解來自前序 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，防止前序 PCR 反應(yīng)的污染。
（3） 用新的反應(yīng)管通過置換不同來源的試劑，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)問題的試劑。
（4） 在條件允許的情況下，在不同的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)建立反應(yīng)，尤其是當(dāng)應(yīng)用質(zhì)粒作為對照時(shí) (質(zhì)?？梢员缓苋菀讛U(kuò)散并且難以去掉)。
圖4
優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)過程需要花費(fèi)一定的時(shí)間，但是所花的時(shí)間是值得的。這樣得出的分析結(jié)果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態(tài)范圍，而且效率高，重復(fù)性好。這些因素使數(shù)據(jù)具有可靠性，并最終為研究界所接受。
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在過去的數(shù)年中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 已成為DNA 或RNA檢測和定量的主要工具，所以，了解并解決實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的常見問題能使我們的結(jié)果更可靠，上期給大家總結(jié)了三種疑難問題（點(diǎn)擊進(jìn)入），今天，將繼續(xù)介紹后三種疑難問題：
四、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的抑制和較低的反應(yīng)效率
在這一點(diǎn)上，應(yīng)將反應(yīng)效率視為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析設(shè)計(jì)和優(yōu)化的關(guān)鍵因素。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(通過對目標(biāo)模板進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應(yīng)的“健康”標(biāo)志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠(yuǎn)。理想的反應(yīng)效率為100%，但反應(yīng)效率在90–110% 范圍內(nèi)都是可以接受的。
導(dǎo)致效率較高或較低的原因：效率高于110% 說明反應(yīng)過程中存在抑制作用。引起抑制作用的原因包括RNA 或DNA 質(zhì)量較差，模板濃度過高及含有核酸純化的殘余物。反應(yīng)效率較低比抑制作用更常見，它是指效率低于90%。其原因包括試劑濃度不適(主要是引物、鎂和Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重實(shí)驗(yàn)中)。造成反應(yīng)效率較低的其它因素包括引物T m 之間的差異超過5°C 以及熱循環(huán)條件不適。效率偏差引發(fā)的問題效率超出90–110% 的范圍可對結(jié)果造成人為影響，易導(dǎo)致假結(jié)論，這主要是由于作為對照的靶序列的效率不同。
此外，抑制作用和較低的效率可影響分析的靈敏度，并導(dǎo)致動態(tài)范圍減小及通用性降低。圖5顯示了不同的擴(kuò)增效率引起的偏差效應(yīng)。四種不同的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)的效率在70% 至100% 之間。其差異在早期循環(huán)并不明顯。但在30 個(gè)循環(huán)之后，效率為70% 的反應(yīng)與效率為100% 的反應(yīng)之間報(bào)告的拷貝數(shù)差異達(dá)100 倍。反應(yīng)的循環(huán)數(shù)越多，分析要求的靈敏度越高，效率差異就顯得越重要。圖6，連續(xù)梯度稀釋模板，評估反應(yīng)效率。Ct 較小的稀釋度呈扁平狀且擴(kuò)增曲線形狀異常。隨著模板逐漸被稀釋，抑制作用消失，曲線也呈現(xiàn)更明顯的特征性指數(shù)期的形狀。
圖5
圖6
1、如何確定是否存在效率偏差現(xiàn)象？
確定某個(gè)特定的分析效率是否低下的最佳方法是稀釋模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(模板稀釋的范圍應(yīng)涵蓋所有未知樣本)，然后查看該范圍內(nèi)的效率。它應(yīng)盡可能接近100%。熔解曲線出現(xiàn)多個(gè)峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著反應(yīng)源物質(zhì)之間存在競爭作用，這必將對反應(yīng)效率產(chǎn)生影響。
2、如何解決低效率或抑制作用？
一旦確定反應(yīng)被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi)。
（1）對于抑制作用，可去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。
（2）另一種解決方案是重新純化模板。切記應(yīng)延長干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
（3）通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時(shí)相對簡單，但在某些情況下，隨著分析復(fù)雜度的提高，優(yōu)化過程可能十分耗時(shí)費(fèi)力。
（4）擴(kuò)增單個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應(yīng)效率，但當(dāng)出現(xiàn)競爭作用時(shí)，則應(yīng)降低鎂的濃度。
（5）在某些情況下(主要是多重反應(yīng)中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時(shí)，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時(shí)甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。最佳引物濃度介于100至600nM之間，而最佳探針濃度則在100nM至400nM 之間。
（6）根據(jù)引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當(dāng)，且引物設(shè)計(jì)時(shí)使之有相似的Tm 值。
五、軟件分析設(shè)置
如前所述，儀器分析有時(shí)會破壞一個(gè)成功的分析。對數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性影響最大的分析設(shè)置包括：擴(kuò)增曲線基線線性度、基線范圍設(shè)置、閾值、參考染料
圖7
1、擴(kuò)增曲線基線線性度
擴(kuò)增曲線基線線性度是影響結(jié)果的參數(shù)之一。儀器軟件通常能夠在曲線的平滑部分自動設(shè)置基線。但當(dāng)Ct值出現(xiàn)過早時(shí)(例如使用18S 作為標(biāo)準(zhǔn)品)，其設(shè)置的基線錯誤地包括了非平直區(qū)域。圖8顯示了同一曲線的不同基線設(shè)置。圖8A 顯示的曲線的基線范圍包括第1至第14個(gè)循環(huán)，由于在第10個(gè)循環(huán)中即可檢測出熒光，因此基線設(shè)置范圍過寬,其結(jié)果是造成曲線下降和Ct 延遲。圖8B顯示基線被重新設(shè)置在第2至第8個(gè)循環(huán)的線性范圍內(nèi)，使曲線和Ct回到準(zhǔn)確的位置上。
圖8
2、基線范圍設(shè)置
基線：一般來講，第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值就是基線?；€范圍設(shè)置常被忽略，但它也可對反應(yīng)效率產(chǎn)生影響。如圖9所示，儀器默認(rèn)設(shè)置通常在分析的可取范圍內(nèi)。但是，手動調(diào)整有時(shí)可進(jìn)一步改善結(jié)果。圖9比較不同的基線設(shè)置方法，達(dá)到可接受的反應(yīng)效率。(A 和D) 這些曲線中基線的手動設(shè)置范圍很寬，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率較低，僅為–2.81，其值不在–3.58 至–3.10 (對應(yīng)于90–110% 的效率) 的最佳范圍之內(nèi)；(C 和F) 我們可以看到與圖A 和D 相同的曲線，但其基線是由儀器自動選擇的?，F(xiàn)在的斜率在最佳窗口范圍內(nèi)，且分析也在動態(tài)范圍內(nèi)；(B 和E) 這些曲線為手動調(diào)整獲得的，在基線內(nèi)另外加入了4 至5 個(gè)循環(huán)，其斜率得到進(jìn)一步改進(jìn)，效率更加接近于100%。
圖9
3、閾值
閾值(超過背景值的熒光強(qiáng)度，用來確定Ct值) 是另一個(gè)由軟件自動設(shè)置的參數(shù)，但也可手動調(diào)整(圖10)。在對同一程序中的多種試劑盒或化學(xué)試劑進(jìn)行評估時(shí)，經(jīng)?？沙霈F(xiàn)上述情況。軟件將自動選擇閾值，此閾值更適合平臺更高的曲線(圖10中的藍(lán)色曲線)。這將導(dǎo)致此數(shù)據(jù)組中的紅色曲線的Ct值出現(xiàn)偏差，因?yàn)槠渥罴验撝当却酥蹈?。因此，需對每個(gè)數(shù)據(jù)組進(jìn)行獨(dú)立研究，這樣才能根據(jù)具體情形選擇最佳閾值。
圖10
4、參考染料
通常，可以將極高和極低的模板包括在檢測極限范圍內(nèi)，因?yàn)槿绻适艿接绊懀瑒t可將終末數(shù)據(jù)點(diǎn)去除。采用諸如ROX 和熒光素等參考染料能夠很好地避免因儀器和用戶所造成的錯誤。這些錯誤十分常見，以至于這個(gè)“幕后”因素經(jīng)常被人們遺忘，其對反應(yīng)的負(fù)面影響也被忽略了。但是，了解儀器軟件與染料本身之間的關(guān)系是十分重要的。對于采用參考染料的儀器來說，其軟件將惰性染料的熒光信號從靶序列發(fā)出的熒光中刪除。因此，如果ROX?的強(qiáng)度過高，可導(dǎo)致目標(biāo)信號返回效果極差，擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)(圖11A)。表面上似乎是反應(yīng)失敗了，需要采取大量的優(yōu)化措施，但從何處開始呢？如果關(guān)閉ROX?通道并重新分析標(biāo)準(zhǔn)品和數(shù)據(jù)，則可發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)實(shí)際上是好的(圖11B)；這是參考染料標(biāo)準(zhǔn)化的問題。
圖11
六、無擴(kuò)增（無Ct值出現(xiàn)）或Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）
Ct值：Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時(shí)候的PCR循環(huán)次數(shù)，跟初始模板的量成反比，見圖12。
圖12
對于無擴(kuò)增現(xiàn)象，一旦確認(rèn)上述問題都有被一一確認(rèn)，那么其他可能帶來無擴(kuò)增的原因包括：
1、低表達(dá)問題
通常基因表達(dá)檢測所需的cDNA 量為1 到100 ng。但是如果您的目的基因的豐量的樣本中很低，可能就需要更多的樣本量。檢測一個(gè)樣本量的范圍，或者更理想的情況下加入陽性對照反應(yīng)確認(rèn)反應(yīng)本身正常。如果您對期望的表達(dá)水平不是很確定，可重新查詢文獻(xiàn)或NCBI Unigene 數(shù)據(jù)庫中EST 表達(dá)數(shù)據(jù)來預(yù)估在不同組織中的表達(dá)水平。
2、逆轉(zhuǎn)錄的問題
與低表達(dá)量相關(guān)，如果您感興趣的基因在樣本中的豐度很低，您需要增加實(shí)驗(yàn)的靈敏度。確認(rèn)一下您的qPCR 反應(yīng)中沒有加入過量的cDNA (最大加樣水平為20% v/v)，因?yàn)檫^量的cDNA 樣本會引入抑制劑降低反應(yīng)效率。您也可以檢查一下逆轉(zhuǎn)錄酶和引物。隨機(jī)引物通常比基于oligo(dT)的方法產(chǎn)生更多的cDNA。另外，有些酶，例如Super- ? III 逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過熱穩(wěn)定性改造，也會提高cDNA產(chǎn)量。檢查您的反應(yīng)中的各組分，通過優(yōu)化各組分提高擴(kuò)增效率。
3、實(shí)驗(yàn)問題
如果沒有見到任何擴(kuò)增，可能是引物/探針的設(shè)計(jì)并未針對正確的靶點(diǎn)。檢查序列數(shù)據(jù)庫如NCBI 搜尋目的基因的不同變異型。有可能實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)知識針對了其中一種變異體，但是在所研究的樣本里并無表達(dá)。同時(shí)還要檢查引物/探針靶向的目的基因的區(qū)域，是在編碼區(qū)還是內(nèi)含子？靶向5’UTR 區(qū)域是不會檢查到轉(zhuǎn)染到細(xì)胞里的外源基因表達(dá)的(因?yàn)?’UTR 區(qū)域是不會包含在表達(dá)載體質(zhì)粒上的)。類似的情況，如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是靶向內(nèi)含子序列的，也是不會從cDNA 樣本中得到擴(kuò)增的。
總 結(jié)
疑難解析是驗(yàn)證和采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析時(shí)必不可少的內(nèi)容。但是，通過對關(guān)鍵問題進(jìn)行分類并加以理解，該過程可變得相對容易。
·確保引物二聚體不會產(chǎn)生信號或造成反應(yīng)效率低下
·采取必要的步驟維持引物和探針的穩(wěn)定性
·反應(yīng)評估過程的最后一步是對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行驗(yàn)證
·了解效率低于90% 時(shí)采用的處理方法與該值高于110% 的處理方法不同
·驗(yàn)證并調(diào)整儀器分析設(shè)置(如有需要)
