Crispr/Cas9在微生物中起到的作用就是識(shí)別入侵、將病毒的DNA錄入自己的基因組，當(dāng)病毒再次入侵時(shí)候，切割病毒DNA、RNA進(jìn)而消除病毒的感染。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細(xì)菌，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進(jìn)化出CRISPR系統(tǒng)，利用這個(gè)細(xì)菌免疫系統(tǒng)，細(xì)菌地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)。
Crispr在編輯基因的時(shí)候，需要2個(gè)成分①Cas9核酸酶；②gRNA（全稱是guide RNA，引導(dǎo)RNA）（需要設(shè)計(jì)里面的部分序列）。
其中Cas9核酸酶的基因已經(jīng)被整合到商業(yè)化載體中，因此使用者只要自行設(shè)計(jì)sgRNA，然后構(gòu)建Cas9/sgRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，就可以行使基因組的定點(diǎn)基因編輯任務(wù)。
gRNA（guided RNA）是CRISPR基因敲除敲入系統(tǒng)中重要的組成部分，由兩部分組成，分別是tracRNA和crRNA。其中crRNA引導(dǎo)cas9定位到要編輯的DNA序列附近，它有一段序列與tracrRNA的一部分是同源的，因此這兩者可以部分結(jié)合。
tracrRNA的作用在于：形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與Cas9蛋白結(jié)合，示意圖如下所示：
將上圖的細(xì)節(jié)放大（圖片來源于Sigma），如下所示：
Cas9和gRNA會(huì)形成一個(gè)Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。這個(gè)RNP就能結(jié)合到基因組上的靶序列上。而基因組上的靶序列如果要被切割，需要滿足兩個(gè)條件： 第一，gRNA與基因組上有17-21個(gè)堿基的同源區(qū)，也被稱為protospace。 第二，靶序列附近有PAM（protospacer adjacent motif），需要注意的是，在設(shè)計(jì)gRNA時(shí)，PAM并不是gRNA的一部分，找公司合成的gRNA時(shí)，里面是沒有PAM序列的。
作用示意圖如下所示： 
在tracrRNA引導(dǎo)下，gRNA與基因組上的靶序列結(jié)合，進(jìn)而RNP切割靶序列，形成一個(gè)DSB。
下圖是Takara官網(wǎng)的原理示意圖：
外源核苷酸是通過Cas 蛋白識(shí)別，入侵的短片段DNA（30-50個(gè)堿基對(duì)）被稱為protospacers，作為間隔序列插入宿 主CRISPR 位點(diǎn)中，由重復(fù)序列隔開。對(duì)于I型和II型系統(tǒng)來說，protospacers來自入侵 DNA 中兩側(cè)出現(xiàn)2-5 個(gè)核酸結(jié)構(gòu)（PAM，protospacer adjacent motif）的區(qū)域。一般 protospacers 連接在CRISPR 位點(diǎn)的一端，并且后者通過涉及 Cas1、Cas2 和 游離3’-hydroxyls 等元件的機(jī)制，牽引序列。Protospacer 的整合過程中也出現(xiàn)了牽引末端重新序列復(fù)制，這可能涉及宿主聚合酶和DNA修復(fù)機(jī)制。如下所示： 
CRISPR RNA 在轉(zhuǎn)錄之后，生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：pre-crRNA，之后經(jīng)過加工，又成為一組短小的 CRISPR衍生RNAs（crRNAs），這些crRNAs 每一個(gè)都包含有對(duì)應(yīng)于之前遇到的外源DNA的對(duì)應(yīng)序列。 
在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活tracrRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，識(shí)別并結(jié)合于crRNA互補(bǔ)的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點(diǎn)剪切crRNA的互補(bǔ)DNA鏈，RuvC活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位點(diǎn)位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征區(qū)域中的NGG位點(diǎn)，而這種特征的序列在每128bp的隨機(jī)DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。
Cas9可以解開DNA，gRNA和target dsDNA配對(duì)是在解旋之后所進(jìn)行（文獻(xiàn)為：Sternberg, S. H., et al. (2014). “DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.” Nature 507(7490): 62-67.）。步驟如下：
下圖是Doudna那篇paper的原理解釋的figure
gRNA 設(shè)計(jì)靶序列選擇：在NCBI找到該基因CDS區(qū)，分析相應(yīng)的基因組結(jié)構(gòu)，明確CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)，選擇候選的待敲除位點(diǎn)，確定待敲除位點(diǎn)。對(duì)于蛋白編碼基因，如果該蛋白具重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子?？蛇x擇將待敲除位點(diǎn)放在起始密碼子ATG后的外顯子上。如果被敲除的靶標(biāo)基因是microRNA或者lncRNA，可以將待敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼成熟microRNA的外顯子或在編碼成熟microRNA的外顯子的5’和3’側(cè)翼序列。
gRNA設(shè)計(jì)：通常情況下我們僅需要在你的目的位置附近找到PAM序列：NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其緊鄰的上游20 nt即可 （如下圖所示）。
從前面的原理中可以知道，這個(gè)gDNA是與基因組上的正義鏈?zhǔn)窍嗤摹?/p>
目的位置的選擇：我們絕大部分時(shí)候的目的是完全敲除一個(gè)基因，其原理是利用移碼突變（CRISPR/Cas系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生indel）。
注：indel全稱為insertion，deletion，即插入，缺失，縮寫為indel， 插入如下： 生物原始基因序列：ATCGTCGAATCCGGTTG 發(fā)生突變基因序列：ATCGTCGAAatcgTCCGGTTG，其中的小寫字母atcg為插入的序列，為插入突變；
缺失： 生物原始基因序列：ATCGTCGAAtccgGTTG 發(fā)生突變基因序列：ATCGTCGAAGTTG，其中，原始序列里的小寫字母tccg為缺失的序列，為缺失突變； 插入和缺失都相對(duì)于原始序列來說：缺失指，在原始序列中的某一段丟失；插入指，相對(duì)于原始序列在某個(gè)位置多了一段序列，即在這個(gè)位置插入了一段序列
因此我們一般選擇距離起始密碼子ATG下游200bp范圍內(nèi)的exon區(qū)域。另外，通常一個(gè)基因往往會(huì)轉(zhuǎn)錄成2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄本，所以請(qǐng)選擇盡量靠近5’端的公共部分，保證每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都會(huì)成功移碼突變。
通常情況下，為了便于下游KO mutants的鑒定，我們往往可以作如下設(shè)計(jì)：即Cas9的切割位點(diǎn)剛好被一個(gè)酶切位點(diǎn)跨過，且附近至少100 bp內(nèi)酶切位點(diǎn)唯一（下游的敲除突變也能通過測(cè)序的手段來鑒定）。
上圖的酶切示意圖就顯示了，敲除突變無法被酶切，而野生型的則能夠進(jìn)行酶切。
不過現(xiàn)在已經(jīng)有了很多在線的gRNA設(shè)計(jì)工具，現(xiàn)在就以其中的一個(gè)為例說明一下。
現(xiàn)在已經(jīng)有很多可以設(shè)計(jì)gRNA的工具，這里直接略過，直接看后文中所附的gRNA設(shè)計(jì)工具即可。
我們實(shí)驗(yàn)室自己使用的是U6-sgRNA-SFFV-spCas9-PURO，示意圖如下所示：
使用的酶切位點(diǎn)是BbsI，使用BbsI切開后的切口如下所示：
因此，在合成gRNA的兩條鏈時(shí)，正義鏈上的oligo序列前面要加一個(gè)cacc，而負(fù)義鏈上的oligo序列前面要加上aaac。
例如我們最終確確定的gRNA序列為CTGTTTGTGCAGGGCTCCGA，它要在兩邊加上caccG，這個(gè)cacc與BsmBI酶切后的gtgg配對(duì)，加G是因?yàn)檫@個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，必須要加上，如果本身第一個(gè)是G，則不需要添加，另一條是5’-TCGGAGCCCTGCACAAACAG-3’，它的兩端要加上aaac與gttt配對(duì)。
那么最終需要合成的序列有2條：oligo1：5’-caccGCTGTTTGTGCAGGGCTCCGA -3’； oligo2：5’- aaacTCGGAGCCCTGCACAAACAGc-3’。加粗部分與經(jīng)BbsI酶切后的載體互補(bǔ)配對(duì)，BbsI的酶切位點(diǎn)如下所示：
BbsI酶的信息如下所示：
全稱：BbsI-HF
貨號(hào)：R3539
保存條件：負(fù)20度
緩沖液：CutSmart Buffer（NEB帶有HF（即High Fidelity）字樣的酶都支持CutSmart）
這里需要注意幾點(diǎn)：
第一：尋找靶序列中的PAM序列，也就是NGG，我們需要注意的是，PAM序列并不是gRNA的一部分，因此在合成gRNA時(shí)，里面是沒有PAM序列的；
第二：RNP在切割靶序列時(shí)，是可以切割任意一條鏈的DNA的（可能是正義鏈，也可能是反義鏈，總之在做敲除時(shí)，最終目的就是破壞DFNA）。
上圖的流程是分三步：
再來看一個(gè)文獻(xiàn)中的案例：
文獻(xiàn)信息如下所示：
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文獻(xiàn)中是使用了cas9編輯了斑馬魚的etsrp基因，文獻(xiàn)中的示意圖如下所示：
紅色方框畫的就是靶序列，在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索斑馬魚的etsrp外顯子2序列，如下所示：
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導(dǎo)入Snapgene，標(biāo)記出來gRNA序列，如下所示：
從上圖可以看到，這個(gè)gRNA序列就是位于正義鏈上。
1. Oligo退火形成duplex
| Component | Volume |
|---|---|
| oligo1 | 1ul(100uM) |
| oligo2 | 1uL(100uM) |
| H2O | 8uL |
| total | 10uL |
PCR儀 95℃ 5 min，緩慢降溫至室溫1h，1：200稀釋duplex。
2. 質(zhì)粒酶切
| Component | Volume |
|---|---|
| lentiCRISPR plasmid | 2ug |
| BbsI-HF（不同的質(zhì)粒有不同的酶切位點(diǎn)） | 1uL |
| 10X buffer | 2uL |
| H2O | X uL |
| total | 10 uL |
加入以上成分，于37攝氏度酶切15分鐘（不同的酶有不同的酶切時(shí)間，這個(gè)要看說明書）。此處使用的Cas9載體的gRNA插入位點(diǎn)如下所示：
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3. 膠回收 大片段約11kb 回收，回收后的線性片段要放到負(fù)80度冰箱，因?yàn)?code>BbsI這個(gè)酶消化后的質(zhì)粒（我自己用的質(zhì)粒）有一端是AAA，容易降解（如果沒有，則放負(fù)20度即可）。
4. 連接
| Component | Volume |
|---|---|
| T4 DNA ligase(TaKaRa,2011A) | 1uL |
| 10 X DNA ligase buffer | 1uL |
| digested lentiCRISPR plasmid | 2uL |
| duplex | 6 uL |
| total | 10 uL |
室溫連接4-6h，隨后轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)要把所有的連接體系加入到感受態(tài)中，因?yàn)檩d體的連接效率不高。
| Component | Volume |
|---|---|
| lentiCRISPR v2-gDNA plasmid | 4ug |
| psPAX2 packaging plasmid | 3ug |
| pMD2.G envelope plasmid | 1ug |
如果是使用Lipo3000進(jìn)行病毒包括，則整個(gè)包括體系如下所示：
| 溶液1 | 溶液2 |
|---|---|
| ① OPTI-MEM 121.25μL | ① psPAX2(1.5μg= X μL)(X) |
| ② lipo3000 3.75μL(或7.5，第一次需要摸索條件) | ② pMD2G(1μg= YμL)(Y) |
| ③ 目的質(zhì)粒(2.5μg= Z μL)(Z) | |
| ④ OPTI-MEM (125μL-X-Y-Z-10= μL) | |
| ⑤ P3000TM試劑 10μL(最后加) |
注：注：（1）包裝質(zhì)粒PAX2 ：pMDG2：和目的基因質(zhì)粒=3:2:5，因此前期工作，每種質(zhì)粒的濃度最好為：[1]psPAX2（500ng/μL）[2]pMD2G（500ng/μL）[3]目的質(zhì)粒（500ng/μL）
（2）Lip3000（μL）∶DNA（μg）的推薦比例為2.5∶1
轉(zhuǎn)染條件與常規(guī)的病毒轉(zhuǎn)染相同。
轉(zhuǎn)染48h后，加入puromycin來篩選細(xì)胞，1mL的培養(yǎng)基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是說嘌呤霉素的終濃度是5μg/mL。
加了嘌呤霉素的培養(yǎng)基要每天更換，每次里面都要含有5μg/mL的嘌呤霉素，這個(gè)時(shí)間要持續(xù)7天。在第7天的時(shí)候，取一定數(shù)量的細(xì)胞，提取DNA，測(cè)序，這一步的目的主要在于，確定是否存在有基因敲除的細(xì)胞，如果沒有，就要重新包病毒進(jìn)行敲除。
如果存在基因敲除的細(xì)胞，那么gRNA切割位點(diǎn)處就會(huì)產(chǎn)生套峰，表示有效編輯的效應(yīng)為50%，如下所示：
當(dāng)測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰時(shí)，表明這批細(xì)胞中存在被敲除的細(xì)胞，此時(shí)就可以分離單克隆了，分離單克隆主要有下面的幾種方法。
有有限稀釋法的過程為：收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞的密度稀釋為500個(gè)/mL，此時(shí)，用20μL移液槍吸取細(xì)胞懸液先點(diǎn)幾個(gè)孔 ,每孔約2μL，然后放在倒置顯微鏡下觀察 ,如每孔 1～2 個(gè)細(xì)胞，說明細(xì)胞濃度合適 ，則可一次點(diǎn)完 96 孔板，每個(gè)孔100uL。
這個(gè)過程也可以使用流式細(xì)胞儀分選，直接分到96孔板中，每孔種1個(gè)細(xì)胞。
單克隆的鑒定
第一種方法，根據(jù)設(shè)計(jì)，推薦使用酶切鑒定的方法（見設(shè)計(jì)部分），通量高；
第二種方法，就是提取細(xì)胞DNA，跑膠，在gRNA序列的上下游設(shè)計(jì)一對(duì)引物，產(chǎn)物長度約500bp，敲除的細(xì)胞的條帶會(huì)縮減，由于gRNA只有20幾個(gè)bp，因此普通的瓊脂糖凝膠不容易看出差異，此時(shí)可以采用SDS凝膠，如果敲除的基因是非編碼的序列，那么就采用測(cè)序法；
第三種方法，測(cè)序，如果不熟悉SDS凝膠，可以采用普通的瓊脂糖凝膠，直接切膠，送測(cè)序；
第四種方法，如果有抗體，可以使用WB的方法。
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