Western Blot雖是實驗室最常用的蛋白分析技術(shù)，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長、影響因素多，所以，導(dǎo)致我們在做實驗時會遇到各式各樣的問題。今天我們總結(jié)了一些WB實驗中經(jīng)常遇到的各種“奇葩”條帶問題，并為你推薦了常用的解決方法，希望對大家有所幫助。
一、 目標(biāo)條帶沒有信號
| 原因分析 | 解決方法 |
| 樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。 | 添加蛋白酶抑制劑。 |
| 目標(biāo)蛋白濃度過低（低于檢測下線）。 | 加大上樣量或提高目標(biāo)蛋白濃度。 |
| 轉(zhuǎn)膜時間太短導(dǎo)致目標(biāo)蛋白沒有充分轉(zhuǎn)移到膜上，或者轉(zhuǎn)膜時間過長導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)穿。 | 控制轉(zhuǎn)膜時間并選擇適合的轉(zhuǎn)印膜。 |
| 一抗的特異性不佳，導(dǎo)致一抗無法識別目標(biāo)蛋白。 | 選用高品質(zhì)抗體。 |
| 一抗反復(fù)使用后導(dǎo)致效價降低，盡管還能與目標(biāo)蛋白連接，但連接蛋白的數(shù)量太少。 | 一抗不宜反復(fù)使用。 |
| 洗脫過渡導(dǎo)致與一抗相結(jié)合的目標(biāo)蛋白被洗掉。 | 洗脫時間的時間和頻率應(yīng)有效控制，一般建議3次10分鐘。 |
二. 圖片背景過高，難以分辨條帶
| 原因分析 | 解決方法 |
| 一抗?jié)舛忍?，?dǎo)致抗體非特異性結(jié)合。 | 降低一抗?jié)舛取?/span> |
| 洗膜的時間和次數(shù)不夠，導(dǎo)致其他蛋白沒有清洗干凈。 | 提高洗脫時間和頻率。 |
| 封閉物用量不足。 | 提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜。 |
| 封閉物使用不當(dāng)。 | 檢測生物素標(biāo)記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉。 |
| 封閉時間不夠。 | 室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜。 |
| 一抗稀釋度不適宜。 | 對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。 |
| 一抗孵育的溫度偏高。 | 建議4℃結(jié)合過夜。 |
三、 膜上出現(xiàn)黑點和黑斑
| 原因分析 | 解決方法 |
| 膜上其他部位與一抗或二抗非特異性結(jié)合，配置的封閉液可能沒有完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導(dǎo)致發(fā)光時候膜上形成黑點。 | 配置封閉液后最好靜止一下，封閉牛奶一定要純，封閉結(jié)束之前要清洗三遍之后再加一抗。 |
| 抗體與封閉試劑反應(yīng)。 | 使用前過濾封閉試劑。 |
| HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體。 | 過濾二抗試劑，去除聚集體。 |
四、 出現(xiàn)非特異性條帶
| 原因分析 | 解決方法 |
一抗非特異性與蛋白結(jié)合，此種情況大多數(shù)情況是因為一抗特異性不好。 | 更換一抗。 |
| 目的蛋白有多個修飾位點，有些一抗還能結(jié)合其他蛋白的結(jié)合位點。 | 更換一抗品種。 |
| 蛋白樣品降解，蛋白酶將目標(biāo)蛋白分解成若干個蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識別。 | 添加蛋白酶抑制劑。 |
五、條帶中出現(xiàn)整條白色空斑
| 原因分析 | 解決方法 |
| 過高的蛋白上樣量或一抗和二抗?jié)舛冗^高都會促使底物過快的消耗，導(dǎo)致我們在做化學(xué)發(fā)光檢測時，發(fā)光底物已經(jīng)消耗殆盡而形成空斑。 | 減少蛋白上樣量、稀釋一抗和二抗的濃度。 |
六、條帶中出現(xiàn)白圈
| 原因分析 | 解決方法 |
轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。轉(zhuǎn)膜時候，膜與膠之間有氣泡。 | 制作“三明治”時，注意趕走氣泡。通常將電轉(zhuǎn)液倒入一個盤子里，液體高度與第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆一些轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗后平鋪在濾紙上，隨后在確認濾紙與膠之間無氣泡后，再往膠上澆一些電轉(zhuǎn)液，之后用雙手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜兩側(cè)中間，使膜成U型，再將U型底部接觸到膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣可以減少氣泡。上層濾紙同樣用U型的放置方法，可以用玻璃棒貼實一下，然后蓋上海綿墊。 |
七、 條帶拖尾
| 原因分析 | 解決方法 |
| 這種情況很容易出現(xiàn)，因為導(dǎo)致條帶拖尾的原因很多，可能性較大的是一抗?jié)舛忍?，作用時間太長或蛋白量過大。 | 根據(jù)情況調(diào)整蛋白量，同時降低一抗的濃度，縮短一抗的時間。 |
八、條帶變形
| 原因分析 | 解決方法 |
| 膠體中存在氣泡，或不溶性雜質(zhì)，膠不均不平整。 | 配膠時用的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無雜質(zhì)。貼邊角加入液體，凝固時避免大幅度動作觸碰。 |
九、條帶呈啞鈴裝
| 原因分析 | 解決方法 |
| 出現(xiàn)啞鈴裝條帶的問題，最大的可能性就是膠沒有配置好，膠凝固后不均一。另外還有一種可能就是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來，然后雜質(zhì)沉淀在孔的中間，蛋白被擠到兩邊。 | 把膠配好，不合格的膠堅決不能用。 |
| 原因分析 | 解決方法 |
| 電泳電流不均一。 | 換電泳槽，或者不使用兩邊的孔。 |
| 原因分析 | 解決方法 |
| 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 膜可能干過。 | 在每一步的操作過程中，都需要注意不要讓膜干掉，確保蛋白面不要被風(fēng)干很長時間，一定要用不漏水的封閉盒并蓋上蓋子，防止過夜16個小時液體流失。 |
| 原因分析 | 解決方法 |
| 條帶呈“微笑U”狀，凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。 | 更換電泳槽。 |
| 條帶呈“倒微笑∩”裝，凝膠左右兩頭沒有凝固好。 | 重新制膠。 |
| 原因分析 | 解決方法 |
| 蛋白分子量偏高或者偏低。 | 可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應(yīng)，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。 |
| 蛋白質(zhì)降解。 | 蛋白質(zhì)降解后很可能會在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。 |
| 所有條帶連成一片沒有間隔。 | 原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。 |
以上是我們對WB條帶出現(xiàn)各種狀況及解決方法的一個總結(jié)，希望可以對大家有所幫助。
