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一、細(xì)胞裂解液配制

方法一

一、試劑準(zhǔn)備
1、新鮮配制冷的 RIPA 裂解緩沖液:
150 mM NaCL
1% NP-40 (去垢劑)
0.1% SDS (去垢劑)
2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
1 mM PMSF (蛋白酶抑制劑)
1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制劑)
1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑)(任選)
以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。

2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF
1.5 mM EDTA
1mM NaVanadate （釩酸鈉）(任選)

3、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)佳的細(xì)胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長(zhǎng)面積）。

二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上，用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的 PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS ，重復(fù)以上操作2-3遍。在最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。
2、向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液 (每75cm2 培養(yǎng)瓶加1ml). 然后用細(xì)胞刮子沿著瓶壁開始刮細(xì)胞，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶，則將第一瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮 (由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點(diǎn)的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于14ml 離心管中（置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細(xì)胞。
4、盡可能將多的細(xì)胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀，應(yīng)離心10000rpm,10分鐘，留取上清。
5、取出小量細(xì)胞裂解液測(cè)其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計(jì)，在A280測(cè)定），分裝保存在 -70℃。

4方法二

NP-40 or Triton-100 1%
TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L
NaCl 150mmol/L
PMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100μg/ml)
Pepstatin(胃蛋白酶抑制劑) 1 μmol/L(0.7μg/ml)
Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/ml
Aprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3μmol/L(1μg/ml)
（注：PMSF 貯存液：100mmol/L即17.4mg/ml于異丙醇中；
Aprotinin 貯存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);
Leupeptin 貯存液：10mg/ml溶于水中；
Pepstatin 貯存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）

裂解操作程序：
* 離心收集1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞
* 加入4℃預(yù)冷1%NP-40裂解液100μl
* 劇烈震蕩使細(xì)胞充分懸浮混勻（如為組織進(jìn)行勻漿）
* 4℃放置15~30min
* 4℃離心，15 000rpm,10min，取上清備用。

方法三

細(xì)胞裂解液的主要目的：1.利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白變性使其穩(wěn)定；4. 抑制蛋白酶活性
推薦RIPA buffer:
. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 緩沖體系
· 150 mM NaCl 等滲體系
· 1 mM PMSF 強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑
· 1 mM EDTA 變性劑和穩(wěn)定劑
· 5 μg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制劑
· 5 μg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制劑
· 1% Triton x-100 破壞細(xì)胞
·1% Sodium deoxycholate 中度變性劑和蛋白溶解劑

細(xì)胞裂解液的主要目的：1.利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白變性使其穩(wěn)定；4. 抑制蛋白酶活性
推薦RIPA buffer:
. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 緩沖體系
· 150 mM NaCl 等滲體系
· 1 mM PMSF 強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑
· 1 mM EDTA 變性劑和穩(wěn)定劑
· 5 μg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制劑
· 5 μg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制劑
· 1% Triton x-100 破壞細(xì)胞
·1% Sodium deoxycholate 中度變性劑和蛋白溶解劑
·0.1% SDS 強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑

其中PMSF等蛋白酶抑制劑最好另外配制，－20℃保存，用前混合。蛋白酶抑制劑較貴，如果你的經(jīng)費(fèi)有限，可以僅用PMSF試一試，能出結(jié)果就可以。
用于普通的 Western、IP或co-IP，我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)，該裂解液已被國(guó)內(nèi)各大研究機(jī)構(gòu)廣泛使用，用戶普遍反映很好。裂解細(xì)胞或組織后，沒(méi)有非常粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測(cè)。對(duì)于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40 裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來(lái)，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無(wú)法被IP下來(lái)，則說(shuō)明裂解液的強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。對(duì)于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或 SDS裂解液。

RIPA裂解體系： 150 mmoL/L Nacl， 1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脫氧膽酸鈉， 0.1% SDS， 50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。

一、組織裂解液配制

組織裂解液配方：`

7M Urea(60. 06) 4.2042 g

2M thiourea(76.12) 1.5224 g

100mM DTT 0.1543 g

4% CHAPS 0.4 g

0.5mM EDTA 0.00146 g

40Mm Tris 0.0485 g

2%(v/v) NP-40 0.2 ml

1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml

5mM PMSF用前加 0.00871 g

2%pharmalyte 0.2ml

共10ml分裝成400μl/每管（可應(yīng)用于30-80毫克組織裂解）

注：已配好分裝成400μl/每管可供應(yīng)用

不需另配?。?！

細(xì)胞裂解液配方：

6M Urea(60. 06) 1.8018 g

2M thiourea(76.12) 0. 7613 g

65mM DTT 0.050 g

4% CHAPS 0.2 g

40Mm Trisbase 0.02425 g

共5ml分裝成200μl/每管（可應(yīng)用于50-100ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞裂解）

細(xì)胞裂解液：組織裂解液配方：

7 mol/L 尿素、 7M Urea(60. 06) 4.2042 g

2 mol/L硫脲、 2M thiourea(76.12) 1.5224 g

2% NP-40、 2%(v/v) NP-40 0.2 ml

1% Triton X-100、 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml

65 mmol/L DTT、 0.1003g 100mM DTT 0.1543 g

5 mmol/L PMSF、 5mM PMSF用前加 0.00871 g

4% CHAPS、 4% CHAPS 0.4 g

40 mmol/L Tris、 40Mm Tris 0.0485 g

2% pharmalyte（pH3-10）、2%pharmalyte 0.2ml

0.5mM EDTA 0.00146 g

25 mg/L DNase I、

7 mg/L RNase A、

20 mg/L aprotinin、

20 mg/L leupeptin、

2 mmol/L Na3VO4、

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1

Phosphatase Inhibitor Cocktail 2

1ml水化液配方：

8M Urea(60.06) 0.48048 g

2% CHAPS 0.02 g

痕量溴酚蘭 0.4 μl

1%的痕量溴酚蘭（10mg+1000μl雙蒸水）

450μl水化液加DTT 0.00135mg

or 400μl水化液加DTT 0.00126mg

各種細(xì)胞裂解液的功用都分別是什么，SDS ，NP-40 ，TritonX-100有何作用

SDS ，NP-40 ，TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的，或者說(shuō)作用力量強(qiáng)弱不同。

SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細(xì)胞完全破掉，DNA會(huì)釋放出來(lái)，裂解液變得很粘稠。

NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對(duì)核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì)使蛋白變性失活）。

但是去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素，建議參考《分子克隆》來(lái)做。

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