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腸道SCFAs豐度檢測顯示，與GF小鼠相比，野生型小鼠除了檢測到乙酸、丙酸、丁酸外，還檢測到戊酸，但戊酸的含量低于其他三種。為了探索戊酸的潛在治療能力，采用IL-6 + IL-23 + IL-1β組合誘導(dǎo)致病性Th17細(xì)胞，戊酸鹽處理后能有效抑制Th17淋巴細(xì)胞的增殖及IL-17A的產(chǎn)生(圖1a)。RNA-seq分析顯示戊酸鹽處理可上調(diào)IL10的表達(dá)，下調(diào)包括Rorc、Il21、Stat3在內(nèi)的大部分Th17相關(guān)基因（其中主要為Tgfb3，由致病Th17細(xì)胞產(chǎn)生）(圖1b)。TGF-β3通過上調(diào)IL-23受體維持Th17細(xì)胞的致病表型。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)過程中，Th17細(xì)胞屬于中樞致病性T細(xì)胞群，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）自身免疫性炎癥的發(fā)展，高致病性Th17細(xì)胞的發(fā)育對EAE的惡性進(jìn)展至關(guān)重要。

作者采用FIR× tiger小鼠誘導(dǎo)EAE，以探究戊酸鹽是否能調(diào)節(jié)CNS的炎癥反應(yīng)。戊酸鹽可改善EAE的嚴(yán)重程度，減少CNS中CD4⁺, CD8⁺T細(xì)胞浸潤的數(shù)量，并在CD4⁺, CD8⁺T細(xì)胞中表現(xiàn)出低頻率的IL-17A⁺和IFN-γ⁺ IL-17A⁺細(xì)胞。之前有報(bào)道過IL-17A⁺ 和IFN-γ⁺ Treg存在于發(fā)炎的CNS中，質(zhì)疑它們在這種高度炎癥的環(huán)境中的抗炎特性。作者發(fā)現(xiàn)在EAE進(jìn)展過程中，FIR× tiger小鼠發(fā)炎的CNS中存在顯著差異的Foxp3⁺ (RFP⁺)Treg共表達(dá)IFN-γ和IL-17A。盡管體內(nèi)戊酸鹽治療沒有改變CNS中Tregs的頻率，但它強(qiáng)烈降低了Foxp3⁺ Treg群體中IL-17A⁺和IFN-γ⁺ IL-17A⁺細(xì)胞的比例。

接下來，作者測試了戊酸鹽可能在非致病菌免疫系統(tǒng)相互作用的背景下抑制腸道Th17細(xì)胞的生成，從而調(diào)節(jié)小鼠EAE的進(jìn)展。分節(jié)絲狀菌(SFB，一種哺乳動物的共生腸道細(xì)菌)可誘導(dǎo)小鼠小腸Th17細(xì)胞的增殖。雖然GF小鼠對EAE發(fā)展具有高度抗性，但這些動物用SFB單核化誘導(dǎo)致病性Th17反應(yīng)并促進(jìn)CNS炎癥(圖1c, d)。戊酸鹽處理SFB-單定植的GF小鼠顯著改善EAE并導(dǎo)致CNS中Th17細(xì)胞的數(shù)量和頻率降低(圖1c-f)。

作者測試了小鼠在各種SCFAs存在下的CD4⁺ T淋巴細(xì)胞組蛋白去乙?；福℉DAC）活性，探索戊酸鹽是否能夠調(diào)節(jié)HDACs活性，結(jié)果顯示丁酸鹽、戊酸鹽和丙酸鹽對HDAC有較強(qiáng)的抑制作用，乙酸鹽和己酸鹽幾乎沒有HDAC抑制作用(圖2a)。戊酸鹽有效抑制HDAC活性可降低IL-17A表達(dá)，用pan-HDAC抑制劑曲古抑菌素A(TSA)處理Th17細(xì)胞也引起相似作用(圖2b)，但作者觀察到TSA不能誘導(dǎo)FIR× tiger小鼠Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-10 (GFP⁺)。為了探討SCFA介導(dǎo)的代謝改變是否能調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡，在2-脫氧葡萄糖(2-DG，糖酵解抑制劑) 存在的情況下，研究戊酸鹽對Th17細(xì)胞中IL-17A和IL-10同時(shí)表達(dá)的影響。戊酸鹽刺激Th17細(xì)胞后，IL-10⁺ (GFP⁺ )細(xì)胞的頻率明顯增加，與2-DG共處理后，完全阻斷了戊酸鹽誘導(dǎo)的IL-10，提示戊酸鹽使得糖酵解作用增強(qiáng)，但對HDAC抑制作用不明顯(圖2b-d)。此外，作者發(fā)現(xiàn)戊酸鹽處理的Th17細(xì)胞細(xì)胞外酸化速率(ECAR)增加，糖酵解活性增強(qiáng)(圖2e)。因此，戊酸鹽(增加IL-10表達(dá))及其抑制HDAC活性(降低IL-17A表達(dá))介導(dǎo)的糖酵解的增強(qiáng)，導(dǎo)致Th17細(xì)胞的代謝、表觀遺傳重編程和致病表型的丟失。

AKT/mTOR信號通路是細(xì)胞進(jìn)程中細(xì)胞對環(huán)境信號作出反應(yīng)的重要調(diào)控因子，能控制癌細(xì)胞和其他細(xì)胞的糖酵解代謝。戊酸鹽是否能夠增加Th17細(xì)胞中mTOR復(fù)合物的活性？用戊酸鹽處理Th17細(xì)胞后，mTOR及其靶分子的活性均增強(qiáng)(圖2f)。AMP活化蛋白激酶(AMPK)活化可阻斷mTOR通路的激活。因此，通過雷帕霉素或AKT抑制劑IV抑制AKT/mTOR信號通路，二甲雙胍激活A(yù)MPK，可顯著抑制經(jīng)戊酸鹽處理的Th17細(xì)胞中IL-10的產(chǎn)生(圖3a, b)。此外，戊酸鹽處理Th17淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞ATP水平顯著升高(圖3c)，推測戊酸鹽可能通過提高ATP水平和消耗細(xì)胞中的AMP來抑制AMPK活性。

在谷氨酰胺存在下，僅用戊酸鹽處理而不控制Th17細(xì)胞，葡萄糖補(bǔ)充后可增加IL-10的生成（圖3d）。葡萄糖存在下，增加谷氨酰胺濃度并不能進(jìn)一步增加IL-10的分泌(圖3e)。這些數(shù)據(jù)表明，戊酸鹽介導(dǎo)的糖酵解代謝增強(qiáng)促使Th17細(xì)胞中IL-10的表達(dá)增加，而這并非由谷氨酰胺代謝導(dǎo)致。由于戊酸鹽處理后的Th17細(xì)胞乙酰輔酶A濃度明顯升高(圖3f) ，推測戊酸鹽可能轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。最近，由ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)介導(dǎo)的糖酵解經(jīng)丙酮酸氧化和隨后檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，被證明對于記憶CD8⁺T細(xì)胞中IFN-γ的快速產(chǎn)生至關(guān)重要。

紫草素(丙酮酸激酶-M2的抑制劑)和SB204990 (ACLY的抑制劑)的抑制導(dǎo)致由戊酸鹽處理的Th17細(xì)胞IL-10的分泌減少(圖3g)。同樣，通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)，用二氯乙酸(DCA)激活丙酮酸脫氫酶(PDH)，將葡萄糖代謝從生成乳酸的需氧糖酵解轉(zhuǎn)移到丙酮酸氧化，即使在沒有戊酸鹽的情況下，也會導(dǎo)致Th17細(xì)胞IL-10的生成升高。通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中添加2-DG可以逆轉(zhuǎn)IL-10的升高(圖3h)。2-DG的存在導(dǎo)致Th17細(xì)胞分泌的乙酸鹽介導(dǎo)的IL-10被阻斷，有力的支持了2-DG對IL-10的逆轉(zhuǎn)作用(圖3j)。

SCFA治療是否會影響調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)產(chǎn)生IL-10。用CpG或LPS(Bregs)刺激脾B細(xì)胞，當(dāng)戊酸存在的情況下，Bregs中IL-10表達(dá)增強(qiáng)(圖4a，b)，而TSA不能顯著增加Bregs中IL-10的分泌(圖4c)。接下來對CpG誘導(dǎo)的Bregs進(jìn)行RNA-seq，主成分分析揭示了對照組和戊酸鹽處理組之間Bregs存在顯著差異(圖4d)。對戊酸鹽組調(diào)控的基因進(jìn)行超幾何富集分析，發(fā)現(xiàn)戊酸鹽處理后，凋亡相關(guān)基因下調(diào)，而促生存相關(guān)基因上調(diào)(圖4e)。膜聯(lián)蛋白V⁺凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)顯示戊酸鹽是唯一一種不僅能夠增加IL-10分泌，而且還能顯著抑制Bregs細(xì)胞凋亡的SCFAs。為了研究戊酸鹽對體內(nèi)Bregs功能的影響，將初始CD4⁺T細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合戊酸鹽處理的Bregs過繼轉(zhuǎn)移到Rag1缺陷小鼠體內(nèi)。用初始T細(xì)胞重組的小鼠在第50天出現(xiàn)進(jìn)行性體重減輕和結(jié)腸炎發(fā)展，而戊酸鹽處理的Bregs轉(zhuǎn)移組，體重減輕得到抑制，免疫病理學(xué)得到改善，結(jié)腸固有層和腸系膜淋巴結(jié)(mLN) CD4⁺效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量減少，這些數(shù)據(jù)表明戊酸鹽將可能被用于穩(wěn)定Bregs抑制表型的治療。

在B細(xì)胞中，p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路活化可誘導(dǎo)IL-10表達(dá)。在p38抑制劑SB203580濃度增加的情況下，用CpG和戊酸鹽處理Bregs，阻斷p38激酶活化，戊酸鹽誘導(dǎo)的Bregs仍能在一定程度上生成IL-10，說明在戊酸鹽介導(dǎo)的Bregs調(diào)控中還涉及其他機(jī)制(圖5a)。有趣的是，戊酸鹽處理后發(fā)生改變的許多基因與代謝途徑有關(guān)，對有或無戊酸鹽時(shí)CpG刺激的Bregs的ECAR，戊酸鹽處理組增加了Bregs的糖酵解和糖分解能力(圖5b)，催化糖酵解限速酶己糖激酶2的表達(dá)增強(qiáng)(圖5c)。用2-DG處理后，戊酸鹽介導(dǎo)的Bregs中IL-10表達(dá)上調(diào)被抑制。同時(shí)抑制糖酵解和阻斷p38 MAPK活化幾乎可以完全消除Bregs中戊酸介導(dǎo)的IL-10生成。有趣的是，只有使用CpG和戊酸鹽治療的Bregs，而不是單獨(dú)使用CpG刺激的Bregs，在葡萄糖補(bǔ)充增加后，IL-10的分泌增加。與PDHK抑制劑DCA共孵育Bregs可促進(jìn)葡萄糖氧化，增加IL-10的生成，而與DCA和2-DG共孵育細(xì)胞IL-10水平降低。與Th17細(xì)胞類似，戊酸鹽處理Bregs可導(dǎo)致AKT和mTOR磷酸化以及mTOR復(fù)合物1的下游靶點(diǎn)（如S6K, S6）水平升高(圖5d)。特異性抑制劑阻斷mTOR上游的信號分子如PI3K(wortmannin)，PDK1(GSK2334470)和AKT(AKT抑制劑IV)可顯著抑制戊酸鹽處理的Bregs中 IL-10的生成(圖5e，f)。

mTOR和p38 (SB203580)聯(lián)合抑制戊酸鹽誘導(dǎo)的Bregs的IL-10的產(chǎn)生，細(xì)胞大小減小 (圖5e-f)。LPS或CpG誘導(dǎo)的2×10⁶ Bregs轉(zhuǎn)移通常不會抑制小鼠EAE的發(fā)生，這可能是由于它們具有較強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡能力。為了分析戊酸鹽誘導(dǎo)的Bregs在體內(nèi)是否能夠抑制自身免疫反應(yīng)， 復(fù)制WT小鼠EAE模型，并在接種戊酸鹽后第0天和第8天(預(yù)防組)或僅在第8天(治療組)接種戊酸鹽后移植2×10⁶ 個(gè)Bregs。未接受治療的小鼠及接受載體Bregs治療的動物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的EAE癥狀：四肢麻痹和免疫細(xì)胞浸潤到CNS。接受戊酸鹽處理的Bregs小鼠由于CNS中缺乏浸潤的致病性淋巴細(xì)胞而沒有表現(xiàn)出自身免疫疾病的臨床癥狀(圖6a-d)。為了測試mTOR復(fù)合物和p38 MAPK對戊酸鹽處理的Bregs抑制能力的影響，隨后將mTOR和SB203580存在時(shí)產(chǎn)生的Bregs轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，其中EAE模型由MOG肽誘導(dǎo)。盡管Bregs因戊酸鹽存在抑制CNS的自身免疫性疾病，而這些細(xì)胞經(jīng)mTOR/p38 MAPK抑制劑預(yù)處理后，對EAE的保護(hù)能力顯著降低(圖6e,g)。上述發(fā)現(xiàn)揭示戊酸鹽在改善分泌IL-10的Bregs抑制活性中發(fā)揮重要作用，將成為未來潛在的治療方法。

膳食纖維依賴性SCFAs對慢性炎癥的有益作用眾所周知，但戊酸鹽可能更適合誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，因?yàn)樗榷∷猁}毒性更小，比乙酸鹽更有效。本研究探索了戊酸鹽是否能夠調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的代謝途徑，從而對炎癥和自身免疫性疾病產(chǎn)生治療作用。揭示戊酸引起B(yǎng)細(xì)胞和CD4⁺效應(yīng)T淋巴細(xì)胞代謝重新分布，導(dǎo)致糖酵解、丙酮酸氧化和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10分泌增加。有趣的是，戊酸鹽雖然具有很強(qiáng)的HDAC抑制活性，卻不能增強(qiáng)粘膜Treg的擴(kuò)張。戊酸鹽的抗炎作用不僅體現(xiàn)在Bregs和CD4⁺效應(yīng)T細(xì)胞中IL-10顯著上調(diào)，還表現(xiàn)在對致病性Th17細(xì)胞表型的有效抑制。通過使用各種特異性代謝活性酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)戊酸鹽依賴的IL-10分泌通過mTOR活性增強(qiáng)、葡萄糖衍生的丙酮酸氧化和乙酰輔酶A產(chǎn)量的增加實(shí)現(xiàn)。在Th17細(xì)胞中，戊酸對淋巴細(xì)胞的代謝和表觀遺傳狀態(tài)存在兩種不同的影響，一方面糖酵解速率增加和丙酮酸氧化誘導(dǎo)IL-10生成，ACLY的阻斷導(dǎo)致IL-10分泌減少；另一方面戊酸鹽的HDAC抑制活性主要抑制IL-17A的表達(dá)，它們共同改善了這些細(xì)胞的抗炎能力。

綜上，戊酸鹽通過T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的代謝和表觀遺傳重編程發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，鑒于代謝和表觀遺傳調(diào)節(jié)和抗炎免疫反應(yīng)之間的平衡，戊酸鹽能夠改善小鼠腸和腦中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理學(xué)。腸道微生物代謝產(chǎn)物戊酸鹽可能作為一種低成本且耐受性良好的潛在藥物，用于多發(fā)性硬化癥和其他TH17介導(dǎo)的自身免疫性疾病的治療，未來更需要研究戊酸鹽的臨床治療潛力。