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研究團(tuán)隊開發(fā)了一個用于分析單細(xì)胞水平代謝基因表達(dá)譜的分析流程（圖1a），每個數(shù)據(jù)集涵蓋了來源于不同基因型和表型背景的人類腫瘤中分離出來的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞（圖1b, c），可以深入研究每種細(xì)胞類型中代謝基因和通路的表達(dá)。研究前期工作發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中代謝基因的表達(dá)在很大程度上是由患者特異性因素決定。來自同一患者體內(nèi)腫瘤的腫瘤細(xì)胞之間代謝基因表達(dá)譜的相關(guān)系數(shù)（平均斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)=0.91）高于來自不同患者的腫瘤細(xì)胞之間的相關(guān)系數(shù)（平均斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)=0.79），來自相同基因型背景的細(xì)胞也比來自不同基因型背景的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的相似性（圖1f, g）。相比之下，非腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的代謝沒有明顯的患者間異質(zhì)性（圖1h, i）。因此，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較高的代謝可塑性，這可能導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞特異性代謝重編程。

為了確定不同細(xì)胞類型，特別是腫瘤和非腫瘤細(xì)胞之間代謝通路差異的總體特征，研究人員量化每個代謝通路的活性值，結(jié)果顯示不同細(xì)胞類型的代謝通路活性存在顯著差異，表明大多數(shù)代謝通路的活性是由細(xì)胞類型決定的。黑色素瘤和HNSCC的腫瘤細(xì)胞代謝通路中上調(diào)變化最多（圖2a, b），包括細(xì)胞代謝的不同通路，如中心碳代謝、一碳代謝、蛋氨酸代謝、類固醇合成和β-丙氨酸代謝。因此，與非腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的代謝活性經(jīng)歷了整體上調(diào)。有趣的是，兩種腫瘤的腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間代謝特征高度一致，而B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的代謝通路活性在這兩種腫瘤之間的相關(guān)性較弱，表明這些細(xì)胞類型的代謝對環(huán)境因素和免疫細(xì)胞的效應(yīng)狀態(tài)更為敏感。

此外，研究人員對單腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜是否與常用腫瘤組織樣本一致進(jìn)行了對比，研究人員將測序數(shù)據(jù)與來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。單腫瘤細(xì)胞和塊狀樣本中通路活性分析表明，不同類型的細(xì)胞之間通路活性的變化高于塊狀腫瘤和正常組織之間的差異（圖2f），并且單腫瘤細(xì)胞的代謝活性和變異性高于塊狀腫瘤。這些結(jié)果表明單細(xì)胞水平的代謝檢測具有更強(qiáng)的分辨率。

腫瘤細(xì)胞代謝重編程還受到特定位置、營養(yǎng)供應(yīng)波動和與鄰近細(xì)胞相互作用的影響，為了確定腫瘤細(xì)胞瘤內(nèi)代謝異質(zhì)性的主要貢獻(xiàn)者，研究人員進(jìn)行了主成分分析（PCA）和基因集富集分析（GSEA），以解釋腫瘤細(xì)胞之間的代謝差異（圖3a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OXPHOS通路和TCA 循環(huán)對多個腫瘤代謝異質(zhì)性有很大貢獻(xiàn)，強(qiáng)于其他的代謝途徑（圖3b,c），表明線粒體活性的變化是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞瘤內(nèi)代謝異質(zhì)性的主要原因。

此外，該研究還對腫瘤細(xì)胞中線粒體活性與氧氣和其他環(huán)境因素之間的關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤和HNSCC中，糖酵解活性與缺氧特征高度相關(guān)（圖3d, e），這與以往研究結(jié)果一致，即缺氧會增加糖酵解活性。值得注意的是，OXPHOS與糖酵解和缺氧反應(yīng)有顯著的相關(guān)性（圖3d, e）。因此，線粒體OXPHOS是瘤內(nèi)代謝異質(zhì)性重要貢獻(xiàn)者，OXPHOS與糖酵解可以適應(yīng)腫瘤微環(huán)境中不同氧供應(yīng)而提供能量且兩者相互不排斥。

對非腫瘤細(xì)胞進(jìn)行同樣的研究分析，發(fā)現(xiàn)OXPHOS和TCA循環(huán)也是所有非腫瘤細(xì)胞代謝異質(zhì)性的主要因素（圖4a, b）。在非腫瘤細(xì)胞線粒體活性與氧氣關(guān)系研究中，與腫瘤細(xì)胞相似，幾乎所有類型細(xì)胞（除HNSCC的巨噬細(xì)胞）的糖酵解、OXPHOS和缺氧都存在顯著相關(guān)性（圖4c, d）。而面臨更嚴(yán)重缺氧的細(xì)胞傾向于上調(diào)糖酵解和線粒體呼吸，這可能有助于細(xì)胞可以更有效地與其他細(xì)胞競爭有限資源。

非腫瘤細(xì)胞如免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。這些細(xì)胞可以分化成不同亞型而具有不同作用，這一過程包括代謝重編程，以滿足細(xì)胞自主代謝需求以及與其他細(xì)胞相互作用。例如，分離CD8⁺ T細(xì)胞和CD4⁺ T細(xì)胞（圖5a），將CD4⁺ T細(xì)胞進(jìn)一步分為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和T輔助性細(xì)胞（Ths）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OXPHOS是區(qū)分T細(xì)胞亞型的最重要代謝通路：在黑色素瘤和HNSCC中，CD4⁺ T細(xì)胞OXPHOS水平均顯著高于CD8⁺ T細(xì)胞（圖5b, c）。與Ths相比，Tregs除了OXPHOS外，還表現(xiàn)出糖酵解上調(diào)（圖5d, e）。因此，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的亞群體具有不同于其在正常組織中的代謝特征。

在HNSCC的腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞（CAFs）或肌成纖維細(xì)胞兩種成纖維細(xì)胞亞型分析中發(fā)現(xiàn)（圖5g），磷酸肌醇代謝是肌成纖維細(xì)胞中唯一上調(diào)的代謝通路，表明CAFs比肌成纖維細(xì)胞更具代謝活性。CAFs糖酵解通路增強(qiáng)，可能會產(chǎn)生多余乳酸可被鄰近腫瘤細(xì)胞利用來支持生長。值得注意的是，其他幾條代謝通路在CAFs中上調(diào)，包括會產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的花生四烯酸代謝和亞油酸代謝、多糖合成和降解的相關(guān)通路。這些通路的上調(diào)可能支持CAFs分泌小分子化合物和蛋白質(zhì)以重塑腫瘤微環(huán)境。綜上所述，CAFs的代謝表型的變化有助于維持它們與其他類型細(xì)胞相互作用和調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。

本研究比較了腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞類型、不同細(xì)胞亞型的代謝特點和代謝通路的異質(zhì)性，揭示了腫瘤代謝異質(zhì)性在單細(xì)胞水平上表現(xiàn)出的與組織水平上的顯著區(qū)別，表明單細(xì)胞水平上的研究對于深入理解腫瘤微環(huán)境的代謝異質(zhì)性至關(guān)重要。在腫瘤微環(huán)境中，不同患者來源的腫瘤細(xì)胞擁有不同的代謝基因表達(dá)特征，但不同類型非腫瘤細(xì)胞的代謝基因表達(dá)并不受患者來源的影響，且不同細(xì)胞類型具有各自獨特的代謝特征。隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和更多腫瘤類型和患者的數(shù)據(jù)積累，對腫瘤細(xì)胞代謝特征的全面描述可能在不久的將來就會出現(xiàn)。