實時熒光定量PCR（ Real-Time qPCR）是分子生物學(xué)最常用的一種方法，它無疑是每個生物實驗者的必備技能！然而對于大多初入實驗的小白來說，qPCR真的一點都不Q，想要做出完美的實驗數(shù)據(jù)需要過關(guān)斬將、披荊斬棘、克服重重困難！
Never mind！
本帖跟隨小麥探索qPCR內(nèi)心世界！
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qPCR基本原理
在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。
視頻講解：
qPCR介紹-Introduction to qPCR
專業(yè)英語Tips
模板 template ，序列 sequence
檢測 detect， 靈敏 sensitive
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qPCR應(yīng)用
目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，還包括：
● 基因擴增
● 擴增特異性分析
● 基因定量分析
● 基因檢測
● 基因分型
● SNP分析
● RFLP多態(tài)性分析
● 單/多基因表達(dá)研究
● 高通量基因表達(dá)譜研究
……
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qPCR常用方法
染料法
熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時，其缺點也在于其非特異性。當(dāng)PCR反應(yīng)中有引物二聚體或者非特異性擴增時，該染料也可以和這些非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。
常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強度、抑制作用等進(jìn)行改進(jìn)，也推出了很多新的染料供大家選擇。
Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye，對qPCR反應(yīng)沒有抑制作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強.
探針法
在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個報告熒光基團，3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。
下表對兩種方法進(jìn)行對比：
染料法 | 探針法 | |
標(biāo)簽 | dsDNA結(jié)合的染料 | 熒光標(biāo)記探針 |
儀器 | 所有qPCR儀器 | 探針需與過濾片匹配 |
特異性 | 檢測所有dsDNA | 檢測探針標(biāo)記的序列 |
復(fù)雜性 | 否 | 是，不同染料/濾光片 |
特異性溶解曲線 | 有 | 不需要 |
通量 | 高 | 極高 |
樣品需求量 | 低 | 極低 |
是否需要驗證 | 是 | 是 |
應(yīng)用 | 基因表達(dá)定量、 DNA定量、 染色質(zhì)免疫共沉淀 | 基因表達(dá)定量、 DNA定量、染色質(zhì)免疫共沉淀、數(shù)字PCR、途徑分析、體細(xì)胞突變檢測、拷貝數(shù)、SNP 基因分型、 mricroRNA |
視頻講解：
染料法vs探針法-qPCR:Dye vs Probe
實驗室小工具
專業(yè)英語Tips
溶解曲線 melt curve ， 變性 denature
報告分子reporter ，猝滅劑 quencher
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qPCR一般步驟
提取RNA ——RT-PCR ——以cDNA為模板檢測
Real-Time qPCR MasterMix一般為預(yù)混液，只需要加入模板和引物就可以。在操作過程中，還需要根據(jù)所用Master Mix、模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。
參比染料（reference dye）的作用是校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個步驟的選擇。
由于進(jìn)行qPCR前需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，因此可以根據(jù)實驗選擇1步法（RT-PCR和qPCR在同一管中進(jìn)行）或2步法（RT-PCR和qPCR分開進(jìn)行）。
下表為大家總結(jié)了兩種方法如何選擇及優(yōu)勢：
如何選擇 | 優(yōu)勢 | |
1步法RT-qPCR | ● 無需儲存cDNA ● 樣本量多，只需擴增少數(shù)幾個目的片段 | ● 操作過程中交叉污染的風(fēng)險更低 ● 快速獲得數(shù)據(jù) |
2步法RT-qPCR | ● 需要儲存cDNA ● 每個樣本要擴增多個目的片段 | ● 可以優(yōu)化RT 和PCR 反應(yīng)的步驟 ● cDNA 可以用于擴增許多不同的目的片段 |
視頻講解：
一步法vs兩步法-1step vs 2step
實驗室小工具
GoTaq? Probe 1-Step RT-qPCR System
GoTaq? Probe 2-Step RT-qPCR System
專業(yè)英語Tips
逆轉(zhuǎn)錄酶 reverse transcriptase
熱循環(huán) thermal cycling
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qPCR常見參數(shù)
基線(baseline)：通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
閾值(threshold)：自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍
Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時候一般取Ct:15-35
Rn(Normalized reporter)：熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果
qPCR定量方法
絕對定量和相對定量的區(qū)別在于，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
