黃玉庭 徐建明
中華腫瘤雜志, 2018,40(3) : 161-165
轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌和直腸癌存在生物學(xué)行為的差異[1]，傳統(tǒng)化療不能取得令人滿意的效果，即使是靶向藥物的加入也往往因耐藥限制了有效性。目前，常通過檢測(cè)腫瘤組織相關(guān)的基因突變預(yù)測(cè)靶向藥物的療效，但存在諸多限制。腫瘤異質(zhì)性使得單次組織活檢并不能完整地代表整體基因改變[2]。外周血作為一個(gè)可實(shí)時(shí)檢測(cè)的液體活檢樣本，因取樣方便、無創(chuàng)，能開展相應(yīng)分子標(biāo)志物檢測(cè)，目前正受到臨床和科研人員的青睞。液體活檢用于診斷或檢測(cè)腫瘤疾病的方法較多，其中循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)能夠真實(shí)地反映實(shí)體瘤組織中的基因突變譜與突變頻率，且能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地反映腫瘤的基因改變[3]，即將在多種腫瘤中取代腫瘤組織作為預(yù)測(cè)靶向藥物療效的樣本。
一、ctDNA的生物學(xué)特性及其臨床應(yīng)用
1．ctDNA的生物學(xué)特性：
20世紀(jì)40年代，Mandel和Metais[4]發(fā)現(xiàn)了循環(huán)核酸，循環(huán)核酸是由機(jī)體細(xì)胞釋放入外周血循環(huán)后發(fā)生部分降解的內(nèi)源性核酸。20世紀(jì)70年代，Leon等[5]的研究結(jié)果顯示，腫瘤患者外周血清DNA(cell－free circulating DNA, cfDNA)的水平明顯高于正常人。20世紀(jì)80年代，Stroun等[6]的研究結(jié)果顯示，cfDNA具有腫瘤細(xì)胞DNA的一些特征，通過對(duì)cfDNA中腫瘤特異性畸變(如腫瘤原癌基因和致癌基因突變、微衛(wèi)星改變和DNA甲基化)的識(shí)別，證實(shí)其為腫瘤細(xì)胞來源的cfDNA，即ctDNA。ctDNA是一類來源于腫瘤細(xì)胞的DNA片段，攜帶有與原發(fā)腫瘤組織一致的分子遺傳學(xué)改變，長(zhǎng)度約150～200 bp，含量極少，濃度約5 ng/ml，半衰期約0.5～2 h，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等液體中，可經(jīng)尿液和糞便排出。健康人群的cfDNA片段主要來源于凋亡細(xì)胞，ctDNA主要來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞，增殖活躍的腫瘤細(xì)胞能主動(dòng)釋放DNA片段到外周循環(huán)中。
2．ctDNA的臨床應(yīng)用：
ctDNA應(yīng)用于臨床具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，只需采集靜脈血，即可對(duì)全身的腫瘤基因信息進(jìn)行測(cè)定，用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、指導(dǎo)抗腫瘤藥物的選擇、療效評(píng)估和預(yù)后判斷等，同時(shí)可從中探索腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和耐藥的分子機(jī)制，鑒別和篩選新的靶點(diǎn)等。ctDNA可以出現(xiàn)在大部分轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中[7,8,9]，這使得結(jié)直腸癌靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)藥物的個(gè)體化治療成為可能。
二、ctDNA的定量檢測(cè)
ctDNA的檢測(cè)方法包括數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)、SafeSeqS、珠乳擴(kuò)磁技術(shù)(BEAMing)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測(cè)序、標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序(TAM－Seq)、全基因組測(cè)序、全外顯子測(cè)序、惡性腫瘤個(gè)體化深度測(cè)序(CAPP－Seq)等。其檢測(cè)分為定性和定量2種，定性檢測(cè)主要檢測(cè)血清或血漿中腫瘤特異性的基因改變，如基因突變、抑癌基因啟動(dòng)子甲基化等；定量檢測(cè)則以血液循環(huán)DNA總量為指標(biāo)，兩者均可反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度。
有研究顯示，不同患者外周血ctDNA的水平差異明顯[7]。Newman等[10]的研究結(jié)果顯示，ctDNA的水平與腫瘤患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷明顯相關(guān)。當(dāng)腫瘤患者對(duì)治療反應(yīng)良好時(shí)，ctDNA的濃度呈下降趨勢(shì)；相反，當(dāng)腫瘤進(jìn)展時(shí)，ctDNA的濃度不斷上升，同時(shí)ctDNA中也出現(xiàn)某些特異性基因改變。Tie等[11]的研究結(jié)果顯示，可通過SafeSeqS技術(shù)定量檢測(cè)治療前后ctDNA的水平變化來評(píng)估腫瘤患者對(duì)治療的反應(yīng)。該研究納入53例接受標(biāo)準(zhǔn)一線化療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，定量評(píng)估化療前后的ctDNA水平變化。結(jié)果顯示，化療前中位ctDNA水平為16.2%，化療3 d后中位ctDNA水平為14.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.139)；而在第2個(gè)周期化療前ctDNA水平就有了明顯下降(0.54%，P<>
除定量監(jiān)測(cè)ctDNA的水平變化外，定量監(jiān)測(cè)ctDNA中基因突變水平的變化也可以評(píng)估結(jié)直腸癌患者對(duì)EGFR單抗治療的反應(yīng)。Siravegna等[12]通過測(cè)定結(jié)直腸癌患者不同時(shí)間點(diǎn)的K－ras基因突變百分比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入EGFR單抗后，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，K－ras基因突變量逐漸增加，終止治療后K－ras基因突變量便開始下降，直到無法檢測(cè)。由此可見，ctDNA中的基因突變水平也呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)改變。此外，Spindler等[13]發(fā)現(xiàn)，ctDNA中K－ras、鼠類肉瘤濾過性病毒原癌基因同源體B1(v－raf murine carcoma viral oncogene homologue B1，BRAF)基因突變與cfDNA存在明確的相關(guān)性。當(dāng)cfDNA水平較低時(shí)，常無法檢測(cè)到ctDNA中的基因突變，但隨著靶向治療的延續(xù)，這些基因突變又會(huì)重現(xiàn)。由此可見，充足的cfDNA水平是ctDNA檢測(cè)的必要前提。只有當(dāng)存在足夠的cfDNA時(shí)，方可進(jìn)一步進(jìn)行ctDNA檢測(cè)。Spindler等[14]在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，可供檢測(cè)ctDNA基因突變的cfDNA水平最低限是每毫升血液中存在3 000個(gè)等位基因片段。
在靶向EGFR單抗治療過程中，結(jié)直腸癌患者的ctDNA基因突變水平呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)改變，既然這是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的量，那么是否存在一個(gè)導(dǎo)致臨床耐藥的基因突變頻率閾值。若能明確這個(gè)閾值，我們便可以通過檢測(cè)血液中ctDNA耐藥基因突變頻率，定量耐藥的發(fā)生情況，就像常規(guī)化驗(yàn)肝腎功能一樣，只需抽取1次靜脈血就可評(píng)估腫瘤患者是否耐藥。盡管目前的技術(shù)在ctDNA中篩選出有價(jià)值的基因突變并不難，但是要明確與耐藥有關(guān)的基因突變頻率閾值，尚需進(jìn)一步研究。
三、ctDNA與結(jié)直腸癌靶向EGFR單抗治療
EGFR單抗包括西妥昔單抗(cetuximab)和帕尼單抗(panitumumab)，其在治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌方面取得了良好的效果，然而幾乎所有的患者在治療后均會(huì)發(fā)生耐藥。其中原發(fā)性耐藥，如RAS家族突變的患者不能使用EGFR單抗。而繼發(fā)性耐藥通常發(fā)生在靶向治療后的3～12個(gè)月，限制了EGFR單抗的臨床獲益。
1．ctDNA與原發(fā)性耐藥：
在臨床上選擇靶向EGFR單抗治療之前，均需要對(duì)腫瘤組織進(jìn)行RAS基因檢測(cè)。Lecomte等[15]探討了37例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血ctDNA中K－ras基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌預(yù)后判斷中的價(jià)值。結(jié)果表明，在EGFR單抗治療之前，發(fā)生K－ras基因突變患者的2年生存率僅為48%，而無K－ras基因突變者的2年生存率可達(dá)100%。Cox回歸分析的結(jié)果顯示，ctDNA中K－ras基因突變是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素，可通過治療前血液中K－ras基因狀態(tài)預(yù)測(cè)其對(duì)EGFR單抗治療的療效和預(yù)后。柏艷清等[16]采用肽核酸鉗制PCR(peptide nucleic acid－PCR，PNA－PCR)和傳統(tǒng)巢式PCR法檢測(cè)了血漿ctDNA中K－ras基因突變豐度與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者療效和預(yù)后的關(guān)系，106例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者根據(jù)是否突變和突變豐度，分為野生型組、低豐度突變組和高豐度突變組，結(jié)果顯示，PNA－PCR法檢測(cè)的K－ras基因狀態(tài)是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，根據(jù)突變豐度決定的血漿K－ras基因狀態(tài)與預(yù)后明顯相關(guān)，高豐度的K－ras基因突變與結(jié)直腸癌較差的預(yù)后明顯相關(guān)。
Xu等[17]對(duì)比分析了242例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血漿樣本間K－ras基因突變與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，K－ras基因突變與較差的預(yù)后相關(guān)，并且這與檢測(cè)樣本和測(cè)序方法無關(guān)，即基于血漿ctDNA的K－ras基因突變分析具有可行性，且與腫瘤組織所包含的信息相一致。此外，研究結(jié)果還顯示，部分患者腫瘤組織與血漿ctDNA間的K－ras基因狀態(tài)存在不一致。Spindler等[18]對(duì)17例腫瘤組織中存在K－ras基因突變而血漿ctDNA中無該突變的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，按照目前的標(biāo)準(zhǔn)，這些患者不適用于EGFR單抗治療，但是其中3例患者對(duì)EGFR單抗治療有反應(yīng)，大部分表現(xiàn)為疾病穩(wěn)定。并且，在血漿ctDNA中檢測(cè)到K－ras基因突變者的無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間更短。由此可見，ctDNA所攜帶的分子生物學(xué)信息與腫瘤組織相一致，能夠很好地替代腫瘤組織。此外，ctDNA能克服腫瘤異質(zhì)性、全面反映腫瘤的整體基因組信息，可提供更多腫瘤組織無法提供的信息。因此，臨床醫(yī)師可以根據(jù)腫瘤患者血漿ctDNA中的基因突變狀態(tài)來篩選出適合EGFR單抗治療的患者。
然而，一些K－ras野生型的結(jié)直腸癌患者也可能對(duì)EGFR單抗沒有反應(yīng)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)證明，NRAS突變、BRAF突變、PIK3CA突變、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor2, HER2)擴(kuò)增、MET擴(kuò)增、K－ras擴(kuò)增及PTEN表達(dá)缺失均可致原發(fā)性耐藥，所有的這些基因改變都是EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路的組成部分或者與該通路相互作用。除了以上這些陰性預(yù)測(cè)指標(biāo)外，EGFR基因拷貝數(shù)可作為陽性預(yù)測(cè)指標(biāo)來預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌對(duì)靶向治療的反應(yīng)性，基因拷貝數(shù)越高、反應(yīng)越良好。此外，人表皮生長(zhǎng)因子受體3(human epidermalgrowth factor receptor3, HER3)及類胰島素生長(zhǎng)因子1(insulin－like growth factor1, IGF1)過度表達(dá)也可能導(dǎo)致了原發(fā)性耐藥。甚至表觀遺傳學(xué)改變也有助于我們預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的療效和預(yù)后[19]。
2．ctDNA與繼發(fā)性耐藥：
即使是最初對(duì)EGFR單抗治療有反應(yīng)的結(jié)直腸癌患者，多數(shù)均會(huì)在治療后的3～12個(gè)月相繼出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[20,21]。Misale等[22]的研究結(jié)果顯示，10例RAS野生型結(jié)直腸癌患者在接受EGFR單抗治療后，1例發(fā)生了K－ras擴(kuò)增，6例發(fā)生了K－ras突變。通過一系列血漿樣本ctDNA分析發(fā)現(xiàn)，K－ras基因突變的出現(xiàn)早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展前10個(gè)月。Diza等[23]也得出了相似的結(jié)論，其選取了24例K－ras野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，予以帕尼單抗治療，其中9例發(fā)生了耐藥，通過檢測(cè)耐藥患者的血漿ctDNA，發(fā)現(xiàn)了K－ras基因突變，其中有3例同時(shí)發(fā)生了多種不同的基因突變。以上研究表明，ctDNA不僅可敏感地發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥的基因改變，更重要的是，它可以比影像學(xué)檢查更早地預(yù)示疾病耐藥。一旦腫瘤發(fā)生了某種有作用基因的改變，最終不可避免地會(huì)出現(xiàn)臨床耐藥，影響靶向治療的有效性。通過ctDNA檢測(cè)能早期發(fā)現(xiàn)耐藥基因改變，及時(shí)終止治療，減少不必要的無效治療和藥物副作用。
在RAS野生型結(jié)直腸癌患者中，是否存在少量已經(jīng)發(fā)生基因突變的腫瘤細(xì)胞呢？Diza等[23]通過數(shù)學(xué)建模推理驗(yàn)證了上述假設(shè)。他們對(duì)結(jié)直腸癌患者的血液進(jìn)行ctDNA分析，結(jié)合腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，估算腫瘤生長(zhǎng)率，建立腫瘤在治療過程中發(fā)生發(fā)展的數(shù)字模型。通過這個(gè)模型，他們反推發(fā)現(xiàn)，K－ras基因突變?cè)谥委熐凹匆缘皖l亞克隆形式存在，只是因?yàn)槌Ｒ?guī)活檢或病理評(píng)估的缺陷而未能檢出。因此可以推斷，繼發(fā)性耐藥的發(fā)生極有可能是在EGFR單抗的藥物壓力之下，使預(yù)先存在的亞克隆突變發(fā)生擴(kuò)增所導(dǎo)致的，當(dāng)然，這并不能排除繼發(fā)性耐藥也可以在靶向治療過程中所獲得。Morelli等[24]的研究結(jié)果也顯示，在接受EGFR單抗治療的結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA中，新發(fā)現(xiàn)的K－ras突變和EGFR突變似乎是來源于腫瘤中預(yù)先存在的少量突變。這些低頻亞克隆突變是否與后續(xù)發(fā)生的臨床耐藥有著絕對(duì)或相對(duì)的關(guān)系，是否存在其他基因突變導(dǎo)致的耐藥，尚不明確。值得注意的是，相對(duì)于腫瘤中預(yù)先存在的少量低頻K－ras突變，后續(xù)在血漿ctDNA中檢測(cè)到的K－ras突變和EGFR突變水平均較治療前有所下降，這表明該基因突變并沒有完全主導(dǎo)整個(gè)腫瘤的遺傳學(xué)改變。如前所述，同一腫瘤患者體內(nèi)也可同時(shí)出現(xiàn)多種基因改變。在藥物、環(huán)境等外部因素的影響下，腫瘤的基因組可能處在不斷變化之中，基因改變呈現(xiàn)出多樣性。那些介導(dǎo)原發(fā)性耐藥的機(jī)制同樣可以導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥[25,26,27,28]。在原發(fā)腫瘤中檢測(cè)到的基因突變并不一定就是后續(xù)導(dǎo)致臨床耐藥的突變，其在治療過程中可能消失，也有可能產(chǎn)生了新的基因突變，同時(shí)其突變頻率呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)改變。
四、基于ctDNA指導(dǎo)下的靶向藥物聯(lián)合治療
既然腫瘤耐藥已成事實(shí)，如果能明確導(dǎo)致耐藥的基因改變就可以促使我們合理地選擇治療方案。結(jié)直腸癌靶向EGFR治療耐藥的基因改變形式多種多樣，甚至在同一患者體內(nèi)也可以出現(xiàn)多種不同的耐藥基因改變。因此，多靶點(diǎn)抗腫瘤藥的開發(fā)和聯(lián)合應(yīng)用顯得尤為重要。多個(gè)研究表明，BRAF V600基因突變對(duì)BRAF抑制劑及MEK抑制劑均敏感[29,30]。Corcoran等[31]對(duì)發(fā)生BRAF V600E基因突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型予以MEK抑制劑AZD6244治療，最開始有治療反應(yīng)，但最終發(fā)生了疾病進(jìn)展。結(jié)果顯示，BRAF基因擴(kuò)增介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞對(duì)MEK抑制劑的耐藥，更重要的是BRAF基因擴(kuò)增也介導(dǎo)了對(duì)BRAF抑制劑AZ628和PLX4720的耐藥。進(jìn)一步研究顯示，聯(lián)合BRAF抑制劑AZ628和MEK抑制劑AZD6244治療可以恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)MEK抑制劑的敏感性。因此，聯(lián)合MEK抑制劑和BRAF抑制劑可以有效地阻止耐藥的發(fā)生。Misale等[28]也通過研究證實(shí)，在發(fā)生EGFR單抗耐藥后，聯(lián)合EGFR單抗和MEK抑制劑AS703026可以使耐藥細(xì)胞恢復(fù)對(duì)EGFR單抗治療的敏感性。
基于結(jié)直腸癌基因改變的多樣性，無論是原發(fā)耐藥還是繼發(fā)耐藥，我們均可以通過ctDNA及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出基因改變，及早在耐藥發(fā)生之前聯(lián)合治療，亦或在耐藥發(fā)生之后及時(shí)補(bǔ)救治療。在靶向治療前，檢測(cè)血漿ctDNA中所發(fā)生的基因改變，若發(fā)現(xiàn)多重基因改變，則早期予以聯(lián)合靶向治療；在靶向治療過程中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA變化，當(dāng)出現(xiàn)新發(fā)基因改變時(shí)，及時(shí)加入該基因抑制劑，延緩甚至逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生。可以預(yù)測(cè)，未來幾年，基于ctDNA指導(dǎo)下的聯(lián)合靶向藥物治療必將給人們帶來一個(gè)新的視野。
ctDNA的檢測(cè)使轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的個(gè)體化靶向治療成為可能，順應(yīng)了當(dāng)前腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的潮流。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，ctDNA的檢測(cè)及其生物學(xué)指標(biāo)的研究，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、療效評(píng)估及耐藥監(jiān)測(cè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，如何將ctDNA檢測(cè)轉(zhuǎn)化于臨床，還面臨諸多難題。一方面，外周血中ctDNA含量相對(duì)較低，現(xiàn)行的檢測(cè)技術(shù)存在敏感性或特異性低、價(jià)格昂貴等問題，迫切需要建立一個(gè)新的敏感、快速、廉價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化ctDNA檢測(cè)方法。同時(shí)，各種檢測(cè)技術(shù)所檢測(cè)的DNA靶標(biāo)不同，缺乏一致性，需制備相關(guān)質(zhì)控品應(yīng)用于全國(guó)各級(jí)醫(yī)院，以進(jìn)行高通量測(cè)序的質(zhì)量評(píng)價(jià)，從而將ctDNA檢測(cè)水平標(biāo)準(zhǔn)化。與腫瘤組織比較，ctDNA中特定基因改變檢出的可靠性及穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，如何解讀ctDNA與影像學(xué)、病理學(xué)等傳統(tǒng)診斷方法的不一致，需要我們進(jìn)一步的探索研究。盡管如此，ctDNA在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后等方面已嶄露頭角，將有望顛覆腫瘤治療領(lǐng)域。
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