通過上一講，我們了解了減毒活疫苗和滅活疫苗的主要特點和差別。從中我們可以了解到，減毒活疫苗其實是非常高效的一種疫苗，其中完成接種后甚至可以提供終身保護(hù)。
那對于新冠大流行的今天，我們也是多么希望也有這樣一款疫苗，能夠接種后提供長久的保護(hù)?。?span>那為啥新冠疫苗已經(jīng)獲批的疫苗中就沒有減毒活疫苗呢？
今天我們就要和大家介紹一款減毒活疫苗—黃熱病17D疫苗開發(fā)的故事，聊一聊開發(fā)一款成功的減毒活疫苗到底有多難。
第一步 認(rèn)識疾病
黃熱病是一種高度致命的病毒性傳染病，導(dǎo)致肝、腎和心肌損傷，出血和休克。目前僅在南美和非洲的熱帶地區(qū)發(fā)生流行。該病的傳播媒介是一種叫做埃及伊蚊的蚊蟲。黃熱病不但可以感染人類，也可以在非人類靈長類動物中傳播。因此黃熱病不能像天花一樣做到根除，唯一可靠預(yù)防該疾病的方法是對易感的人群進(jìn)行疫苗接種。
在歷史上，黃熱病曾經(jīng)在整個美洲和西非地區(qū)肆虐。歷史上影響最大的一次疫情發(fā)生于1793年，在當(dāng)時美國羽翼未豐的聯(lián)邦首都費(fèi)城，那里占總?cè)丝?0％的人因為感染黃熱病而喪生。當(dāng)時，黃熱病被廣泛認(rèn)為是由污物，污水和腐爛的有機(jī)物引起的一種空氣傳播的“ 瘴氣”。
小說《熱病1793》記錄了1793年費(fèi)城暴發(fā)黃熱病的恐怖場景
在沒有找到致病因素的情況下，疫苗接種是一個遙不可及的目標(biāo)。一直到1878年，在密西西比河下游地區(qū)的一次暴發(fā)仍然有20,000人死亡。如果你是福爾摩斯探案集的忠實粉的話，一定記得有一篇叫做“黃面人”的短篇小說，里面女主人公的前夫就是死于美洲暴發(fā)的黃熱病。
福爾摩斯探案集-黃面人中女主角的前夫死于黃熱病
十九世紀(jì)下半葉，包括卡洛斯·芬萊在內(nèi)的幾位醫(yī)生提出，黃熱病是通過蚊子傳播的。當(dāng)時疾病的細(xì)菌理論和科赫關(guān)于微生物因果關(guān)系的假設(shè)已經(jīng)被歐洲主流科學(xué)所接受，芬萊在此基礎(chǔ)上提出蚊子攜帶黃熱病的“病菌”。
古巴流行病學(xué)家卡洛斯·芬萊發(fā)現(xiàn)黃熱病是通過蚊子從感染的人傳播到健康的人的
1900年，時值美西戰(zhàn)爭期間，黃熱病在古巴島上流行，對占領(lǐng)的美軍構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。由美軍少校沃爾特·里德（Walter Reed）領(lǐng)導(dǎo)的黃熱病委員會證明該病原是一種可過濾的病毒，并且可通過直接注射血液或由埃及伊蚊傳播。
沃爾特·里德（1851-1902）
他們發(fā)現(xiàn)如果是通過蚊子傳播，蚊子叮咬患者以后，要經(jīng)過12天的體外潛伏期才具有傳染性，也就是病毒在蚊子體內(nèi)還有一個復(fù)制的過程。他們還發(fā)現(xiàn)人類如果被具有傳染性的蚊子叮咬后，到發(fā)病中間也需要間隔3-6天的潛伏期。
第二步 找到病原體
雖然之后，很多人也證實了里德的發(fā)現(xiàn)，但從病因?qū)W上的“病毒”卻沒有得到分離和鑒定。
美國陸軍外科醫(yī)生沃爾特·里德少校及其對黃熱病起因的發(fā)現(xiàn)是醫(yī)學(xué)和人類歷史領(lǐng)域最重要的貢獻(xiàn)之一
一直到1927年，廣泛的黃熱病席卷了非洲沿海地區(qū)，由洛克菲勒基金會建立的西非黃熱病委員會成員亞歷山大·馬哈菲，在加納，將一名名叫阿西比（Asibi）的28歲的病人血液接種到恒河猴體內(nèi)。四天后，猴子垂死并顯示出與黃熱病相一致的肝損傷。將該猴子的血液再次接種第二只動物后，又一次引起了臨床黃熱病。
首先從這位叫Asibi的加納患者體內(nèi)分離到了黃熱病毒
于是黃熱病的病原終于被找到了。
第三步 讓病毒在實驗室活下去
黃熱病委員會的研究人員通過在猴體內(nèi)連續(xù)直接傳代和通過埃及伊蚊間接傳代建立了Asibi病毒株，而Asibi將會是此后17D疫苗的母本病毒株。除了確定黃熱病的致病因子并確認(rèn)它是可過濾的病毒因子外，研究人員還證實恒河猴是易感宿主，這為測試未來的候選疫苗提供了寶貴的研究工具。
洛克菲勒西非黃熱病研究委員會在西非實地
就在差不多時候，法國巴斯德研究所位于達(dá)喀爾的分支，從一名敘利亞患者中分離了黃熱病病毒，起名為“法國病毒株”。
分離Asibi病毒株和法國病毒株是開發(fā)疫苗的關(guān)鍵。
第四步 試試滅活疫苗行不行
使用新分離的病毒進(jìn)行主動免疫的最早嘗試是1928年在倫敦惠康研究實驗室的愛德華·欣德爾，他使用從感染了法國病毒株的猴子肝臟和脾臟組織制備的疫苗，并用福爾馬林或甘油-酚滅活。皮下注射滅活疫苗的恒河猴在一周后再接種大劑量病毒后仍存活下來，而未接種疫苗的動物死亡。
但是當(dāng)時缺乏有效的病毒繁殖，效價測量和滅活過程控制方法，從而阻礙了滅活疫苗的制備。一些制劑可能包含負(fù)責(zé)免疫的殘留活病毒，而另一些則在滅活過程中降解且缺乏效力。
1929年，洛克菲勒研究所國際衛(wèi)生部實驗室的后來主任威爾伯·索耶和紐約洛克菲勒基金會的同事生產(chǎn)了由感染黃熱病的恒河猴血清經(jīng)過化學(xué)處理制造的疫苗。這些制劑的的抗原活性和安全性都不一致，導(dǎo)致研究人員得出結(jié)論，化學(xué)處理劇毒病毒不太可能產(chǎn)生安全可靠的疫苗。
黃熱病滅活疫苗就此宣告失敗。
第五步 建立小動物模型
1928年，哈佛醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)系主任安德魯·沃森·塞拉茲（Andrew Watson Sellards）從達(dá)喀爾巴斯德研究所帶回了含有法國黃熱病毒株的恒河猴肝感染樣本。
馬克斯·泰勒（Max Theiler）被委托將此材料用于開發(fā)感染的小動物模型。
馬克斯·泰勒（1899–1972）
泰勒出生于南非的比勒陀利亞，曾在倫敦圣托馬斯醫(yī)院接受醫(yī)學(xué)培訓(xùn)。泰勒用具有感染性的達(dá)喀爾猴肝懸浮液在腦內(nèi)接種成年的小鼠；所有動物均死于腦炎，無肝損害跡象。隨后將這些小鼠的腦組織接種到恒河猴中，引起典型的致命黃熱病，并伴有肝病。
小鼠模型的成功代表了黃熱病研究的一個里程碑。
第六步 通過小動物連續(xù)傳代，得到穩(wěn)定的病毒
如果大家還記得，將近50年前，巴斯德（Pasteur）就曾經(jīng)在疫苗研制過程中通過脊髓內(nèi)或腦內(nèi)途徑感染了狗，猴，豚鼠和兔子的狂犬病。而泰勒就是沿襲了巴斯德的做法。
泰勒嘗試通過小鼠腦內(nèi)一系列連續(xù)傳代來減毒黃熱病病毒。他發(fā)現(xiàn)接種經(jīng)過29和42次傳代后小鼠腦物質(zhì)的猴子在感染中幸存下來，沒有臨床癥狀，并且對強(qiáng)病毒的攻擊具有抵抗力。
病毒在小鼠中的連續(xù)傳代過程中其嗜神經(jīng)性增加了，這表明連續(xù)傳代病毒可能最終達(dá)到神經(jīng)毒力的穩(wěn)定階段，即被“固定”，就像巴斯德將狂犬病毒在兔腦中連續(xù)傳播后所發(fā)生的一樣，其中固定病毒對犬的致病性較小。
最終，泰勒在小鼠中傳代法國毒株超過100代，產(chǎn)生了一種“固定”病毒，接種和動物死亡之間的間隔為4天。這項工作為疫苗奠定了基礎(chǔ)。
黃熱病的嗜神經(jīng)性和嗜內(nèi)臟性被認(rèn)為具有獨特的病毒特性。泰勒觀察到，如果將黃熱病病毒經(jīng)腦內(nèi)途徑接種恒河猴后，猴子死于肝炎，而非腦炎。相反，通過小鼠腦內(nèi)傳代固定了嗜神經(jīng)性的病毒，已經(jīng)喪失了在猴子中產(chǎn)生肝炎的能力。
泰勒的發(fā)現(xiàn)，加上受到黃熱病健康威脅的患病人群眾多，以及實驗室研究人員接二連三感染黃熱病的刺激，促使科學(xué)家們下定決心，要開發(fā)一種基于通過小鼠腦中連續(xù)傳代的減毒活疫苗。
第七步 毒力減不夠，免疫血清來補(bǔ)充
洛克菲勒研究小組的第一個黃熱病疫苗是利用泰勒在小鼠中傳代獲得的“固定病毒”以及人類血清制造的。
這個的病毒株已經(jīng)經(jīng)小鼠大腦傳代多達(dá)176次，而人類免疫血清則是為了保護(hù)人類免于減弱的病毒減毒不足而添加的。他們的方法非常細(xì)致，可以說是代表了當(dāng)時活疫苗開發(fā)的最安全方法。
初步研究表明，疫苗和血清沒有產(chǎn)生不良反應(yīng)，并且產(chǎn)生了明確的免疫力。1931年，洛克菲勒大學(xué)的科學(xué)家在研究所的研究醫(yī)院對住院病人進(jìn)行了人類接種。沒有觀察到明顯的不良反應(yīng)。輕度不良事件包括局部壓痛和充血，發(fā)燒和關(guān)節(jié)痛，是由于疫苗的腦組織成分引起的，而不是由黃熱病病毒感染引起的。
隨后，用小鼠腦病毒進(jìn)行血清疫苗接種成為實驗室工作人員免疫的標(biāo)準(zhǔn)方法，這些實驗室工作人員感染黃熱病的風(fēng)險很高。到1934年，紐約，巴西，哥倫比亞和阿根廷已有56人接受了接種；倫敦惠康科學(xué)研究所進(jìn)行了類似的研究。
但是，人體免疫血清的需求遇到了短缺的問題。嘗試使用動物抗血清替代人血清的嘗試引起了對反應(yīng)原性、外來的動物病原體和成本的擔(dān)憂。此外，在標(biāo)準(zhǔn)化條件和在疫苗制備中控制病毒-血清混合物的體外中和的技術(shù)的困難也是其廣泛使用的主要障礙。
洛克菲勒小組認(rèn)為這種嗜神經(jīng)性病毒作為獨立疫苗過于危險，因此采取了另一種方法，開始尋找致病性較低的病毒株，并尋求改進(jìn)的疫苗制造方法。
第八步 如果不用免疫血清，難道就不行嗎
哈佛大學(xué)的Sellards和突尼斯巴斯德研究所的Laigret于1932年率先使用不含免疫血清的法國病毒株接種人類，使用的是使用感染了經(jīng)過傳代134代的神經(jīng)適應(yīng)性法國病毒株的10％小鼠腦懸浮液。其中一些人出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用，包括惡心，嘔吐，腹痛，活動過度，反射異常，咯血和蛋白尿。
Laigret認(rèn)為，減毒不充分的嗜神經(jīng)性病毒是造成這種情況的原因，因此他重新努力通過改變配方和降低劑量來開發(fā)一種更為安全的疫苗開發(fā)方案。
其中有一種方案是從巴斯德最初的狂犬病疫苗方法中借用的，就是先接種病毒在小鼠大腦中培養(yǎng)4天的“老病毒”，然后以20天的間隔分別再給予培養(yǎng)2天和1天的病毒。
還有一種方法是利用低溫減毒，將病毒在20℃下“減毒”24小時并且使用蛋黃或者橄欖油包被。后者被認(rèn)為可以減慢病毒從接種部位的擴(kuò)散。
因此，在7年的時間里，盡管未經(jīng)對照的臨床試驗，但嗜神經(jīng)疫苗已從最初的人體試驗過渡到大規(guī)模的試驗。到1939年，西非已有20,000多人接受了上述兩種疫苗接種方案之一。
隨著更多人接種疫苗，最初對安全性和耐受性的擔(dān)憂基本得以消除。但是，令人擔(dān)憂的是盡管沒有進(jìn)行仔細(xì)的隨訪研究，但有中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重反應(yīng)的報告出現(xiàn)。
第九步 換一種培養(yǎng)方法，換一種病毒毒株
索耶、泰勒和洛克菲勒基金會的其他科學(xué)家認(rèn)為法國的疫苗嗜神經(jīng)性風(fēng)險太高，需要一種新的方法來減輕嗜神經(jīng)病毒的危險。為此，泰勒及其同事利用了一種新開發(fā)的體外培養(yǎng)技術(shù)。
在1932年，泰勒證明了嗜神經(jīng)性法國病毒也可以在雞胚組織培養(yǎng)物中繁殖，但是嘗試培育未經(jīng)改變的原始法國病毒株卻失敗了。
于是，他們開始采用Asibi病毒株代替了法國病毒進(jìn)行研究。
1936年，Asibi病毒株首次成功地進(jìn)行了體外培養(yǎng)。經(jīng)過240次傳代后，盡管命名為17E的病毒在腦內(nèi)接種后仍保留了產(chǎn)生腦炎的能力，但對恒河猴失去了嗜內(nèi)臟性。
17E病毒被認(rèn)為尚未充分減毒，殘留的神經(jīng)毒力使其仍然需要同時使用免疫血清，因此只是在在實驗室工作人員的血清免疫接種方案中替代了原有的嗜神經(jīng)的病毒。
第十步 去除嗜神經(jīng)性，17D疫苗得以問世
在初次繁殖時使用的切碎的整個小鼠胚胎中存在的神經(jīng)組織負(fù)責(zé)維持培養(yǎng)的病毒的嗜神經(jīng)性，促使泰勒在進(jìn)行連續(xù)的病毒傳代之前從培養(yǎng)基上除去大腦和脊髓組織。
最重要的實驗傳代病毒株-命名為17D-使用已在完整小鼠胚胎中傳代培養(yǎng)18次的病毒，隨后在完整切碎的雞胚培養(yǎng)物中傳代了58次，此后該病毒在去除了神經(jīng)組織的切碎的雞胚中傳代。
通過小鼠的腦內(nèi)接種測試了后一個子代的每一個的嗜神經(jīng)性。休·史密斯（1902-1995）負(fù)責(zé)17D血統(tǒng)實驗的監(jiān)督。
休·史密斯不但協(xié)助泰勒開發(fā)了17D疫苗，還對其在巴西的臨床研究和應(yīng)用功不可沒
在去除神經(jīng)組織的雛雞胚胎中連續(xù)傳100次傳代后（即開始體外培養(yǎng)后第176傳代），史密斯觀察到攻擊的小鼠不再進(jìn)展成致死性麻痹。在恒河猴中，該病毒的嗜內(nèi)臟毒性也明顯減弱，皮下接種后既不引起明顯的病毒血癥，也不引起肝炎。
進(jìn)一步確定，在繼代培養(yǎng)物第89和114代之間發(fā)生了猴子神經(jīng)毒性的喪失，在第114和176代之間減弱了小鼠的神經(jīng)毒性。
接種減毒病毒的猴子產(chǎn)生了中和抗體，并抵抗了野生型Asibi病毒的致死性攻擊。體外和臨床前數(shù)據(jù)表明，可以在不添加保護(hù)性免疫血清的情況下，將17D病毒作為人疫苗安全地進(jìn)行測試。
第十一步 小規(guī)模臨床研究：安全比有效更重要
遵循早期關(guān)于傳染病研究的悠久傳統(tǒng)，17D疫苗最初接種的兩個人類受試者是泰勒和史密斯，他們都是低風(fēng)險的人，因為他們都具有免疫力：泰勒是在1929年在哈佛期間因偶然的實驗室感染而致病，而史密斯通過接種法國嗜神經(jīng)病毒和免疫山羊血清獲得免疫力。
在成功為另外兩個免疫對象接種疫苗后，對五個非免疫個體給予了高劑量的減毒病毒。盡管出現(xiàn)了少量發(fā)熱反應(yīng)，但該產(chǎn)品耐受性良好，所有受試者的血清保護(hù)性中和抗體水平均升高。
泰勒和史密斯在黃熱病疫苗研究中已達(dá)到關(guān)鍵的里程碑。
第十二步 大規(guī)模臨床應(yīng)用
在紐約進(jìn)行的17D初步臨床測試獲得了令人滿意的結(jié)果，隨后它迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樵邳S熱病威脅公眾健康的國家-巴西使用。
在1937年1月到達(dá)里約熱內(nèi)盧的1個月內(nèi)，史密斯開始了小規(guī)模的人體試驗。他首次在24位未感染的對照工作者中證明了17D疫苗的耐受性和免疫原性，盡管在大約一半的受試者中記錄了短暫病毒血癥。
隨后，他與Henrique de Azavedo Penna一起在當(dāng)?shù)氐狞S熱病實驗室建立了疫苗生產(chǎn)能力，并進(jìn)行了額外的對照組免疫，并在6個月內(nèi)擴(kuò)大了疫苗的現(xiàn)場試驗范圍。
選定的疫苗評估地點位于巴西東南部Mineas Gerais州的Varginha，那里的咖啡種植園工人黃熱病高發(fā)。到1937年8月，已有2,800多名受試者接種了疫苗，沒有明顯的不良反應(yīng)。到年底，已有38,077人接種了17D疫苗。
該疫苗似乎是安全且具有免疫原性的，超過95％的受測受試者會產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)。在此期間，使用雞蛋生產(chǎn)疫苗的方法得到了改進(jìn)。在里約熱內(nèi)盧的奧斯瓦爾多·克魯茲基金會實驗室擴(kuò)大了生產(chǎn)規(guī)模，使用了17D疫苗來抵抗疫情。
到1938年底，將近100萬巴西人已經(jīng)接種了17D疫苗。一年后，開始了本地生產(chǎn)相對便宜的疫苗的工作，包括疫苗，疫苗用具和現(xiàn)場使用所需的復(fù)雜冷鏈，估計每劑制造成本僅為當(dāng)時的 10美分。
盡管從未以受控方式進(jìn)行正式測試，但根據(jù)多年的經(jīng)驗，人們接受了17D黃熱病疫苗的療效。
非人類靈長類動物的大量臨床前數(shù)據(jù)表明，它具有抗野生型病毒致死性攻擊的保護(hù)活性。人17D免疫后，會迅速出現(xiàn)中和抗體，其中基于17D疫苗的中和抗體應(yīng)答在美國接種疫苗的成年人中的有效率為99％，在秘魯接種疫苗的嬰兒中則超過95％。
流行病學(xué)觀察同樣證明了疫苗的有效性。黃熱病的實驗室感染在常規(guī)免疫之前很普遍，但此后消失。此外，超過50年的觀察表明，南美國家的叢林黃熱病僅發(fā)生在未免疫的人中，暴發(fā)期間的免疫應(yīng)急接種可以使得病例迅速消失。
我國生產(chǎn)的黃熱減毒活疫苗也是使用17D病毒株
黃熱病17D疫苗長期以來被認(rèn)為是最安全的活疫苗之一。神經(jīng)性不良事件很少發(fā)生， 1960年終止對6個月以下嬰兒的免疫接種后，安全性得到了進(jìn)一步改善。
一種穿越了疫苗不同時代才得以成功開發(fā)的疫苗
1951年，洛克菲勒基金會的科學(xué)家馬克斯·泰勒成為唯一因病毒疫苗的開發(fā)而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的人。他的黃熱病17D減毒活疫苗并不是第一個在人類中進(jìn)行測試的黃熱病疫苗，但它是迄今為止最成功的黃熱病疫苗。自20世紀(jì)30年代后期問世以來，已經(jīng)分發(fā)了超過5億劑。
泰勒是歷史上唯一一位因為成功開發(fā)病毒疫苗而獲得諾獎的科學(xué)家
黃熱病疫苗開發(fā)的故事之所以引人注目，部分原因是它跨越了疫苗歷史的多個時代。
它的起源始于19世紀(jì)末，恰逢由微生物學(xué)和免疫學(xué)的啟示驅(qū)動的疫苗接種概念迅速發(fā)展的時期。而疫苗真正成功的20世紀(jì)30年代，又處于病毒學(xué)出現(xiàn)的早期。在這個前分子時代，病毒基因型在不同宿主中傳遞時的基因型變化只能通過遵循生物學(xué)特性（如毒力）來間接研究。
盡管嘗試重現(xiàn)導(dǎo)致17D內(nèi)臟和神經(jīng)嗜性減弱的傳代過程，但泰勒無法解釋原始傳代89到176代之間發(fā)生的變化。通常，連續(xù)傳代的病毒衰減導(dǎo)致生物學(xué)表型的變化非常不可預(yù)測。
17D疫苗開發(fā)的成功歸因于系統(tǒng)、細(xì)致的應(yīng)用經(jīng)驗以及有準(zhǔn)備的頭腦進(jìn)行的敏銳而持續(xù)的觀察。當(dāng)然，成功也離不開幸運(yùn)。
由于黃熱病對醫(yī)療和公共衛(wèi)生的影響，公眾和科學(xué)界被迫采取潛在的預(yù)防措施，其中一些措施被證明無效或危險。
在此過程中，吸取了許多經(jīng)驗教訓(xùn)，這些經(jīng)驗教訓(xùn)已成為疫苗開發(fā)和評估常規(guī)的一部分：可控安全性評估的重要性；定量效能測定；熱穩(wěn)定性評估；生產(chǎn)過程中病毒傳代的標(biāo)準(zhǔn)化和控制；神經(jīng)毒性和內(nèi)臟毒性的敏感標(biāo)志物；控制病毒變異；以及監(jiān)測罕見的不良事件。
新冠疫苗能夠用減毒活疫苗技術(shù)開發(fā)嗎？
包括黃熱病17D疫苗在內(nèi)，歷史上有好幾種非常成功的人類減毒活疫苗。它們都是基于實際病原體的減毒株，其毒力基因通過體外傳代而喪失或突變。由于病毒在被接種的個體中復(fù)制，因此免疫應(yīng)答很可能通過抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答靶向結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白。
如果通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行開發(fā)，就像黃熱病17D那樣，這將非常耗時，沒有十幾年的時間根本不可能獲得成功。如果使用反向遺傳學(xué)進(jìn)行開發(fā)，比如通過合理修飾病毒（例如通過密碼子去優(yōu)化或刪除功能基因）來實現(xiàn)衰減抵抗先天免疫識別，開發(fā)速度會快得多，但在技術(shù)上將具有挑戰(zhàn)性。
同時需要特別指出的是，要產(chǎn)生一種用作疫苗的病原體減毒株，就需要證明其無法通過基因還原而變成病原體。在冠狀病毒的情況下，這尤其具有挑戰(zhàn)性。因為已知它們會在自然界中重組，并且從理論上講，減毒的疫苗株可與野生型冠狀病毒重組以重建致病株。
目前只有三種減毒活疫苗處于臨床前開發(fā)階段，所有這些都通過密碼子去最優(yōu)化而減毒。而最終能否獲得成功，還需要我們耐心等待。
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