摘要
靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞在治療B細(xì)胞惡性腫瘤患者取得令人矚目的成果。盡管這CAR修飾的T細(xì)胞靶向相同的抗原，其CAR分子設(shè)計不同，并且臨床研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)已被研究。目前還不清楚這些差異是否會對臨床結(jié)果和治療相關(guān)毒性產(chǎn)生影響。在此，我們根據(jù)CAR分子設(shè)計和制備的不同，回顧了靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在治療B細(xì)胞惡性腫瘤患者的臨床研究結(jié)果，比較這些研究之間的內(nèi)在局限性并進(jìn)行概述。
引言
嵌合抗體受體修飾的自體T細(xì)胞在治療難治性B細(xì)胞惡性腫瘤獲得了較高的緩解率。CAR是由胞外單鏈可變區(qū)（scFv）抗體衍生物構(gòu)成的重組受體，與胞內(nèi)T細(xì)胞受體信號域連接，使T細(xì)胞獨立于HLA對腫瘤具有特異性。幼稚T細(xì)胞的增殖與分化，需要兩種特異性抗原肽的相互作用：MHC與T細(xì)胞受體結(jié)合（第1信號）以及T細(xì)胞表面共刺激受體與靶細(xì)胞或特定的抗原呈遞細(xì)胞相應(yīng)配體相互作用的共刺激信號。
已經(jīng)有數(shù)代CAR被開發(fā)并進(jìn)行了臨床試驗研究。第一代CAR為連接在T細(xì)胞受體/CD3復(fù)合體的CD3ζ內(nèi)切域的靶向特異性scFv。第一代CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出有限的擴(kuò)增性和持久性，以及有限的抗腫瘤效應(yīng)，第二代CAR加入了共刺激分子（如CD28、4-1BB）以提供第二信號，第三代CAR則是串聯(lián)多個共刺激域。
不同機(jī)構(gòu)構(gòu)建的靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在治療兒童和成人復(fù)發(fā)B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL），慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL），和B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）表現(xiàn)出穩(wěn)定高效的抗腫瘤效力。各機(jī)構(gòu)產(chǎn)品在CAR的設(shè)計、T細(xì)胞活化與轉(zhuǎn)導(dǎo)方法以及細(xì)胞劑量上有所不同（表1）。在本綜述中，作者側(cè)重于一些CD19-CAR-T治療惡性血液疾病成熟和初步的臨床研究，注重臨床結(jié)果，相關(guān)毒性和體內(nèi)T細(xì)胞的持久性，并根據(jù)治療方案的差異對觀察到的結(jié)果進(jìn)行分析。
表1：臨床試驗中CD19-CAR結(jié)構(gòu)概要
單鏈可變區(qū)是CAR的抗原識別部分。? 表示38人入選，24人接受了方案劑量治療并列入分析。Cy=環(huán)磷酰胺，F(xiàn)lu=氟達(dá)拉濱，ORR=客觀緩解率（可評估患者），CR=完全緩解，PR=部分緩解，MRD-=微小殘留病灶陰性，DLBCL=彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，F(xiàn)L=濾泡性淋巴瘤，MCL=套細(xì)胞淋巴瘤，F(xiàn)S=無復(fù)發(fā)生存率，LFS=白血病無病生存，PFS=無進(jìn)展生存期，OS =總體生存期。
靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療成人B-ALL
紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC）和費(fèi)雷德記癌癥研究中心（FHCRC）公布的CD19-CAR-T治療成人復(fù)發(fā)性B-ALL研究數(shù)據(jù)最多。MSKCC團(tuán)隊在美國血液學(xué)會（ASH）公布了他們利用CD28共刺激域（19-28ζ）CAR治療46例成人患者階段性成果?；颊吒唢L(fēng)險特點包括≥3次的一線治療（n=26），接受過異基因造血干細(xì)胞移植（alloHSCT,n=18）以及費(fèi)城染色體陽性（n=14）。T細(xì)胞輸注前，25例患者具有形態(tài)學(xué)的疾病負(fù)荷（骨髓原始細(xì)胞≥5%或髓外浸潤），21例患者有微小殘留(骨髓原始細(xì)胞＜5%)，45例可評估患者中有37例達(dá)到或維持形態(tài)學(xué)完全緩解（CR），36例可評估患者中有30例經(jīng)流式細(xì)胞檢測微小殘留為陰性（MRD-）。完全緩解率沒有對年齡、疾病負(fù)荷、一線治療次數(shù)以及異基因造血干細(xì)胞移植等因素進(jìn)行分類。37例CR患者中13例曾接受異基因造血干細(xì)胞移植，但接受異基因造血干細(xì)胞移植和沒有接受造血干細(xì)胞移植的患者6個月總生存期（OS）沒有差異（分別為79%和80%）。6個月OS患者保持MRD-占80%。18例患者在隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)，其中3例患者檢測不到CD19的表達(dá)。
在ASH會議上FHCRC的研究人員公布了CD19-CAR-T治療29例成人患者I期臨床試驗的最新研究結(jié)果。與MSKCC的主要差異在4-1BB共刺激域（vs CD28）以及CD4+與CD8+細(xì)胞單獨單獨培養(yǎng)并按1:1的比例進(jìn)行輸注。這個小組近期公布的前期臨床研究表明，定義了T細(xì)胞組成的CD19-CAR-T產(chǎn)品，最有效的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞亞群（即CD4+細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子更多，尤其幼稚CD4+ CAR-T細(xì)胞可極強(qiáng)促進(jìn)具有中央記憶表型的CD8+CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)），總劑量更低單個患者間劑量更均一，并且可能產(chǎn)生增效作用。10例患者曾接受過異基因造血干細(xì)胞移植，CAR-T輸注前骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)為17%（范圍：0~97%）?？稍u估的12例患者接受環(huán)磷酰胺（Cy）淋巴細(xì)胞刪除性化療有10例患者獲得骨髓緩解，10例患者中7例復(fù)發(fā)（中位復(fù)發(fā)時間66天）。5例患者經(jīng)CAR-T細(xì)胞再處理無應(yīng)答。愛康得Paul推測更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞刪除性化療可增強(qiáng)T細(xì)胞的持久性，后續(xù)的患者采用氟達(dá)拉濱（Flu）25mg/m2 x3天和環(huán)磷酰胺60mg/kg的方案。所有接受Cy/Flu的患者都獲得骨髓CR，并且接受Cy/Flu方案的患者無疾病生存期比接受Cy單藥方案的患者長。輸注后獲得/維持CR的患者M(jìn)RD狀態(tài)尚未確定。、
CD19-CAR-T治療兒童B-ALL
費(fèi)城兒童醫(yī)院（CHOP）/賓夕法尼亞大學(xué)（UPenn）研究者對含4-1BB共刺激分子靶向CD19的CAR-T(CTL019)治療25例兒童復(fù)發(fā)B-ALL進(jìn)行詳細(xì)的報道。12%患者為第一次復(fù)發(fā)，88%患者復(fù)發(fā)次數(shù)≥2次，72%患者曾接受過異基因造血干細(xì)胞移植。白細(xì)胞采集術(shù)后，患者接受主治醫(yī)師的臨時治療。最新結(jié)果顯示在CTL019輸注前62%患者具有形態(tài)學(xué)疾病負(fù)荷，38%患者有微小殘留。6例初次復(fù)發(fā)的患者中有3例通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不到CD19的表達(dá)，CTL019細(xì)胞持續(xù)存在。2015年ASH年會上研究人員對CTL019治療53例兒童/青壯年復(fù)發(fā)難治B-ALL患者最新結(jié)果進(jìn)行報告（表1）。41例可檢測的B-ALL，12例患者M(jìn)RD-。53例患者有50例獲得/維持形態(tài)學(xué)CR，50例可評估患者通過流式細(xì)胞術(shù)檢測有45例患者M(jìn)RD-。20例輸注CTL019復(fù)發(fā)的患者中，13例原始細(xì)胞CD19陰性。根據(jù)西雅圖兒童醫(yī)院的初步報告，愛康得Paul認(rèn)為使用含4-1BB共刺激域（JCAR017）有利于提高復(fù)發(fā)難治性B-ALL的完全緩解率，盡管成熟的研究數(shù)據(jù)尚未被報道（NCT02028455）。
美國國立癌癥研究所（NCI）的研究者進(jìn)行了20例CD19-CAR-T治療兒童復(fù)發(fā)性B-ALL的安全性和有效性進(jìn)行了研究。與CHOP相反，65%患者之前沒有進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植。20例患者中有14例獲得/維持CR，14例中12例MSD-。這12例患者中有10例隨后進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植，除了這10個人其他都未進(jìn)行造血干細(xì)胞移植。CD19-CAR-T輸注后不足6個月有4例患者復(fù)發(fā)，2例在輸注后獲得MRD+的完全緩解，2例在輸注后獲得MRD-的完全緩解，但未接受異基因造血干細(xì)胞移植。研究者對復(fù)發(fā)患者再次進(jìn)行CAR-T輸注（第一次輸注后2-2.5個月），沒有出現(xiàn)客觀應(yīng)答。
CD19 CAR-T治療CLL和B-NHL
盡管首次探討CD9-CAR-T治療CLL和B-NHL患者，并且缺乏成熟數(shù)據(jù)報告。Upenn的研究者使用CTL019治療40例復(fù)發(fā)難治性CLL患者。他們以摘要的形式報告了II期臨床劑量優(yōu)化研究，26例復(fù)發(fā)難治性CLL患者在淋巴細(xì)胞刪除性化療后隨機(jī)接受5x107 (n=13) vs. 5x108 (n=13) CTL019。高風(fēng)險包括P53/17p染色體異常（n=10）以及依魯替尼耐藥（n=2）。23例患者中有9例獲得客觀應(yīng)答，包括5例獲得CR，在這些CR患者中MRD狀態(tài)未報道，劑量與應(yīng)答關(guān)系并不明顯。3例患者在獲得響應(yīng)后疾病進(jìn)展，表現(xiàn)出CD19陰性侵襲性淋巴瘤（n=2）或CTL019丟失（n=1）。最近，研究人員發(fā)表了一份詳細(xì)的CTL019探索性治療14例成人復(fù)發(fā)性CLL的后續(xù)報告?；颊咔捌谥委煷螖?shù)中位數(shù)為5，6例患者有染色體缺失。14例患者有8例出現(xiàn)明顯的客觀反映，4例患者在CTL019輸注后獲得CR，獲得CR的患者在3個月后進(jìn)行免疫球蛋白重鏈深度測序分析得出MRD為陰性。所有獲得PR患者在治療后5-13個月出現(xiàn)復(fù)發(fā)，獲得CR的患者未出現(xiàn)復(fù)發(fā)，中位數(shù)為40個月（范圍：21~53個月）。
NCI的研究中使用CD19-CAR-T治療8例患有復(fù)發(fā)性CLL和B-NHL的患者。除了淋巴細(xì)胞刪除性化療，患者在細(xì)胞輸注后接受IL-2治療直至毒性消除。響應(yīng)持續(xù)了7-18個月，1例獲得CR的CLL患者發(fā)生B細(xì)胞再生障礙。該小組隨后使用低劑量CAR-T細(xì)胞對15例化療難治性DLBCL和其他惰性B-NHL進(jìn)行治療，并且不使用IL-2。7例可評估的難治性DLBCL患者有4例獲得CR，其中3例獲得持久應(yīng)答（9-22+個月），3例CLL患者通過流式細(xì)胞術(shù)對骨髓進(jìn)行檢測，評價為獲得持久性CR（14~23+個月）
在2015ASH年會上，UPenn和FHCRC的研究者展示了CD19-CAR-T細(xì)胞治療成人復(fù)發(fā)難治性B-NHL的初步成果。UPenn報告了38例成人復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者在淋巴細(xì)胞刪除性化療后使用CTL019。24例患者接受了CTL019方案的規(guī)定使用劑量，22例可評估患者中有15例產(chǎn)生了客觀應(yīng)答，包括7/13的DLBCL和7/7的濾泡性淋巴瘤（FL），獲得CR的比例尚不清楚。在FHCRC的試驗中，CD4+和CD8+細(xì)胞以1:1的比例擴(kuò)增與輸注，這與他們在B-ALL中的研究相似。FHCRC報告中28例B-NHL患者中有16例曾接受造血干細(xì)胞移植（自體13例，異體3例）。12例基于環(huán)磷酰胺淋巴細(xì)胞刪除性化療的患者大部分CAR-T細(xì)胞持續(xù)性短，與FHCRC在成人ALL中的研究經(jīng)驗相似，觀察到了鼠源CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)。12例患者中有6例觀察到客觀應(yīng)答反應(yīng)（CR 1例[DLBCL]，PR 5例）,5例患者再次治療未出現(xiàn)進(jìn)一步的臨床反應(yīng)。同樣，在隨后的16例患者中淋巴細(xì)胞刪除性化療增加使用氟達(dá)拉濱，觀察到客觀反映率為67%，（CR 42%）,8例DLBCL有6例產(chǎn)生客觀應(yīng)答（CR 3例），3例FL有2例獲得CR。額外6例復(fù)發(fā)難治性CLL患者，在輸注4周后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測有5例患者外周血和骨髓的原始細(xì)胞得到完全清除。
MSKCC的研究者還報道了復(fù)發(fā)難治性PET陽性和/或骨髓浸潤B-NHL患者，在進(jìn)行大劑量化療和自體造血干細(xì)胞移植后接受5x106-1x107 19-28z CAR-T細(xì)胞/kg劑量的CAR-T挽救性治療。截至2015年ASCO年會，11例入組患者有6例獲得CR，其中4例仍在持續(xù)CR（13~21+個月）。
CD19-CAR-T細(xì)胞毒性
所有的CD19-CAR-T試驗都報道了治療相關(guān)性毒性反應(yīng)，特別是CRS，神經(jīng)毒性和B細(xì)胞發(fā)育不全，雖然觀察到的毒性嚴(yán)重程度不相同。CRS是在CAR-T輸注后數(shù)小時到數(shù)天內(nèi)發(fā)生的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其特征為促炎性細(xì)胞因子的增高和T細(xì)胞的活化與擴(kuò)增，臨床癥狀包括發(fā)燒，肌痛，乏力，在嚴(yán)重情況下，出現(xiàn)與毛細(xì)血管滲漏綜合征相關(guān)的缺氧，低血壓，偶發(fā)的腎功能不全以及凝血功能障礙。試驗使用不同定義對CRS進(jìn)行分級，而當(dāng)前的不良事件通用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE）CRS分級只對輸液相關(guān)癥狀進(jìn)行描述。嚴(yán)重的CRS可使用IL-6受體拮抗劑妥珠單抗進(jìn)行抗細(xì)胞因子治療，或者使用糖皮質(zhì)激素治療。所報告的種類，發(fā)生率，嚴(yán)重程度和CRS治療，神經(jīng)毒性都總結(jié)在表2中。B細(xì)胞再生障礙是CD19-CAR-T的毒性和有效性標(biāo)志物，尤其在CAR-T持久存的患者身上可以觀察到。部分B細(xì)胞再生障礙在靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）后可能會消失。
CD19-CAR-T治療兒童B-ALL的毒性
根據(jù)CHOP和UPenn研究者公布研究報告，他們觀察到接受治療的全部25例兒童患者都發(fā)生了CRS。根據(jù)其最近更新的數(shù)據(jù)顯示，53例患者中除了5例患者，其余患者都發(fā)生了≥1級的CRS（表3）。嚴(yán)重CRS（需要給予升壓藥）與C-反應(yīng)蛋白（CRP），鐵蛋白，IL-6，IFN-γ及可溶性IL-2受體升高相關(guān)。輸注CTL019后嚴(yán)重CRS比輕/中度CRS發(fā)生得早（中位數(shù)1 vs 4天）。高疾病負(fù)荷和高水平的CD3+CD8+ CTL019 細(xì)胞與CRS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。同樣，NCI報道20例受試患者有15例發(fā)生CRS。CRS評價發(fā)生在輸注后的4天（范圍：1-7天），并且平均持續(xù)4.8天。他們都用自己的分級系統(tǒng)來定義CRS（表3）。最初給藥劑量為3x106 CAR-T細(xì)胞/kg，4例患者有2例發(fā)生3-4級CRS，隨后確定最大耐受劑量為1x106 CAR-T細(xì)胞/kg。在較低劑量下（1x106 CAR T細(xì)胞/kg）16例患者有4例（25%）發(fā)生3-4級CRS，所有患者都具有高疾病負(fù)荷。少部分患者使用了高劑量T細(xì)胞使我們推斷T細(xì)胞劑量與嚴(yán)重CRS的關(guān)聯(lián)受到局限。愛康得Paul認(rèn)為高疾病負(fù)荷和嚴(yán)重的CRS相關(guān)聯(lián)。所有CRS都是完全可逆的（總結(jié)于表2）。研究人員對17例患者在治療的1個月內(nèi)進(jìn)行了腦脊液(CSF)的取樣，檢查腦脊液中CAR-T細(xì)胞的存在，并報告了CSF中CAR-T與神經(jīng)毒性的關(guān)系。因樣本量較小，僅有6例出現(xiàn)神經(jīng)毒性的患者在CSF中檢測到CAR-T。此外，在MSKCC對成人B-ALL的研究中并未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒性與CSF中是否存在CAR-T的相關(guān)聯(lián)。
CD19-CAR-T治療成人B-ALL的毒性
46例復(fù)發(fā)性B-ALL患者接受MSKCC 19-28ζ CAR T細(xì)胞治療，有11例發(fā)生嚴(yán)重CRS（即需要升壓藥或機(jī)械通氣）。發(fā)生嚴(yán)重CRS的患者在CAR-T細(xì)胞輸注時都有形態(tài)學(xué)疾病負(fù)荷。此外，研究顯示T細(xì)胞劑量與嚴(yán)重CRS相關(guān)聯(lián)。11例有形態(tài)學(xué)病灶的患者接受3x106 19-28ζ CAR T細(xì)胞/kg，有3人發(fā)生與治療相關(guān)的5級毒性（敗血癥、多功能器官衰竭）。隨后對細(xì)胞劑量進(jìn)行了調(diào)整，具有形態(tài)學(xué)疾病負(fù)荷的患者接受劑量為1x106 19-28ζ CAR T細(xì)胞/kg。而疾病負(fù)荷很低的患者接受劑量為3x106 19-28ζCAR T細(xì)胞/kg。14例具有形態(tài)學(xué)病灶的患者與21例疾病負(fù)荷較低的患者都沒有發(fā)生5級治療相關(guān)毒性?；颊咴贑AR-T細(xì)胞輸注后出現(xiàn)神經(jīng)毒性類似于對兒童治療的報道。雖然嚴(yán)重CRS僅發(fā)生在高疾病負(fù)荷的患者，但21例僅有微小病灶的患者有3例（14%）發(fā)生3-4級的神經(jīng)毒性。NCI的研究人員同樣在治療成人B-ALL中觀察到疾病負(fù)荷和嚴(yán)重CRS的相關(guān)性。
在2014ASH年會上，UPenn的研究者公布了CART019治療復(fù)發(fā)性B-ALL I期臨床試驗的初步結(jié)果。12例患者有11例出現(xiàn)了嚴(yán)重的CRS。11例嚴(yán)重CRS患者中有8例經(jīng)IL-6拮抗劑治療后獲得緩解，但3例患者對妥珠單抗和糖皮質(zhì)激素耐受，在CART019輸注后3-15天內(nèi)死亡。這3例患者都具有較高的疾病負(fù)荷，在接受環(huán)磷酰胺300mg/m2 q12h x6后輸注劑量為6.5–8.45x106 CTL019細(xì)胞/kg的CAR-T細(xì)胞。這3例患者相對于另外9例患者接受了更高劑量（平均高3.62x106細(xì)胞/kg）的CAR-T細(xì)胞，愛康得Paul認(rèn)為這表明高劑量的細(xì)胞與毒性的增加可能相關(guān)聯(lián)，這也在MSKCC和NCI的研究中也被觀察到。
CD19-CAR-T治療成人CLL和B-NHL的毒性
UPenn的研究者在使用CTL019治療CLL的患者中觀察到遲發(fā)性CRS，一些患者在CTL019輸注后55天才需要接受抗細(xì)胞因子治療。CRS與T細(xì)胞擴(kuò)增峰值相關(guān)，但是與B-ALL不同，治療前高疾病負(fù)荷不能對CRS進(jìn)行預(yù)測。盡管使用像治療成人B-ALL那樣高劑量的T細(xì)胞治療CLL患者，但沒有出現(xiàn)5級CRS。然而有1例B-NHL患者發(fā)生5級腦炎可能與CTL019治療相關(guān)。FHCRC報告稱在B-NHL患者中使用Cy淋巴細(xì)胞刪除性化療后輸注2x105-2x107 CAR-T細(xì)胞/kg沒有出現(xiàn)劑量相關(guān)性毒性（DLT）,盡管在7例患者在Cy和Flu預(yù)處理接受2x107 CAR-T細(xì)胞/kg輸注后，有2例患者在輸注后第一天IL-6升高預(yù)示會發(fā)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)。NCI研究小組發(fā)現(xiàn)，15例BLBCL或惰性B細(xì)胞血液惡性腫瘤的患者有13例出現(xiàn)≥3級毒性，主要出現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞輸注2周內(nèi)。IL6和/或IFN-γ升高同時毒性反應(yīng)最重。在MSKCC的研究中，復(fù)發(fā)難治性侵襲性B-NHL患者在高劑量化療和自體干細(xì)胞治療后輸注19-28ζCAR T細(xì)胞，DLT引發(fā)的CRS細(xì)胞劑量水平為1x107 19-28ζ/kg。11例患者有6例發(fā)生嚴(yán)重CRS，使用妥珠單抗和糖皮質(zhì)激素都獲得了有效的治療。
愛康得Paul認(rèn)為，治療前高疾病負(fù)荷與嚴(yán)重CRS風(fēng)險的增加相關(guān)，而用高劑量CAR-T治療CLL和B-NHL患者沒有出現(xiàn)這一的相關(guān)性。而類似CD19-CAR引發(fā)神經(jīng)毒性的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。CSF中存在CAR-T被認(rèn)為是一個潛在因素，但在CSF中檢測到CAR-T卻不一定出現(xiàn)神經(jīng)毒性癥狀，這表明它們不太可能介導(dǎo)神經(jīng)毒性。
CAR-T在體內(nèi)的擴(kuò)增與持久性
CAR-T在體內(nèi)的持久性通常被認(rèn)為CAR-T治療發(fā)揮長期臨床療效的標(biāo)志。在某種程度上，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法來衡量CAR-T在血液或骨髓中持續(xù)時間數(shù)據(jù)。最廣泛的CAR-T持續(xù)性數(shù)據(jù)來自CHOP、UPenn和NCI的研究，他們都使用流失細(xì)胞術(shù)和定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（qPCR）來檢測CAR-T在體內(nèi)的擴(kuò)增和持久性。表面表達(dá)CAR分子的CAR-T細(xì)胞可以用流式細(xì)胞術(shù)檢測，而細(xì)胞表面沒有表達(dá)CAR的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞需要qPCR檢測。CHOP在兒童B-ALL患者的研究中，研究者利用qPCR對CTL019進(jìn)行長達(dá)2年的檢測，DNA定量拷貝數(shù)下限為5 copies/μg。有趣的是，有3例對CTL019沒有任何應(yīng)答的患者qPCR檢測到很高的峰值（6,066-178,481copies/μg DNA），而流式細(xì)胞術(shù)卻沒有檢測到循環(huán)CTL019的存在。UPenn的研究者使用qPCR檢測接受治療的成人CLL患者體內(nèi)CAR-T的持久性，指定檢測下限為<25 copies/μg DNA。他們報道指出擴(kuò)增與持久性的程度與應(yīng)答相關(guān)，有4例獲得MRD-的完全緩解的患者CTL019持續(xù)了14-49個月，其中一些患者B細(xì)胞再生障礙持續(xù)了4年。同樣，在治療CLL患者的劑量優(yōu)化試驗中，愛康得Paul發(fā)現(xiàn)在所有出現(xiàn)應(yīng)答的患者體內(nèi)CTL019都出現(xiàn)擴(kuò)增，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測在在擴(kuò)增高峰CTL019在CD3+細(xì)胞中所占比例較高。
NCI用qPCR分析兒童B-ALL患者的下限量為100 copies/μg DNA。通過qPCR或流式細(xì)胞術(shù)檢測，在輸注后第14天CAR-T在體內(nèi)擴(kuò)增達(dá)峰值，在輸注后68天后所有患者都檢測不到擴(kuò)增，并且伴隨著正常B細(xì)胞再生。然而，在此項研究中CAR-T持久性分析是有限的，因為大多數(shù)患者在獲得MRD-的完全緩解后平均51天（范圍45-82天）進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植。有4例患者在檢測到CAR-T就立即準(zhǔn)備進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植，異基因造血干細(xì)胞移植后就不在進(jìn)行CAR-T細(xì)胞檢測。
NCI研究者報道在B-NHL患者中外周血CAR-T持久性達(dá)181天。峰值出現(xiàn)在輸注后的前10天并且變化范圍很大。根據(jù)他們的最新報告，在7-17天檢測到CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的最高峰(9–777 CAR+ 細(xì)胞/μL)，之后就會迅速下降。沒有指明擴(kuò)增峰值和應(yīng)答明確的相關(guān)性，也沒有指明最長持久性。
目前還不清楚加入4-1BB共刺激域是否可以延長CAR-T的持續(xù)時間（如：可能改善T細(xì)胞耗竭），或因為免疫清除的一些因素限制了CAR-T的持久性（如NCI和FHCRC報道的CTL介導(dǎo)的抗CAR應(yīng)答）和/或淋巴細(xì)胞刪除不充分。此外，一些患者檢測不到循環(huán)CAR-T仍保持分子緩解，CAR-T最佳持續(xù)時間仍然未知。事實上，誘導(dǎo)持續(xù)緩解應(yīng)答和效力深度比持續(xù)時間更加關(guān)鍵，因為有些患者盡管CAR-T細(xì)胞存在，但仍然會CD19陰性疾病復(fù)發(fā)。
CD19-CAR-T細(xì)胞治療的應(yīng)用：認(rèn)識與分歧
轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的替代
本文所描述的研究是利用γ逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染效率高，能可靠地生產(chǎn)出所需求劑量的T細(xì)胞制品。與之相比，MD安德森癌癥中心（MDACC）已經(jīng)研究使用非病毒睡美人（SB）系統(tǒng)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一系統(tǒng)的潛在局限性包括轉(zhuǎn)到效率降低，生產(chǎn)所需的細(xì)胞制品需要更長的時間。有點包括無需病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)成本避免病毒致癌風(fēng)險。MDACC報道了13例B細(xì)胞惡性腫瘤患者（ALL8例，B-NHL3例，CLL 2例）其中有些患者接受過異基因造血干細(xì)胞移植，進(jìn)行了劑量為1x106–5x107 CAR T-細(xì)胞/m2的CAR-T治療，3例患者健在，平均在輸注后3個月緩解。另外12例患者（ALL10例，B-NHL2例）在接受了異基因造血干細(xì)胞治療后接受了1x106–5x107細(xì)胞/m2的供者來源 CAR-T，患者全部健在，并且在輸注后處于緩解期平均5個月。這些早期數(shù)據(jù)表明使用SB系統(tǒng)制造較低活性CAR-T細(xì)胞的可能性，其他變化因素包括CAR的共刺激域，淋巴細(xì)胞刪除方案。更健全和成熟的數(shù)據(jù)回顧有助于闡明基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，CAR-T終制品的表型，擴(kuò)增，持久性和臨床療效的相關(guān)策略。
第一代vs.第二代CAR
研究顯示共刺激信號在臨床前模型中的重要性。幾項小規(guī)模早期臨床研究中第一代CAR-T被證明臨床療效和持續(xù)性有限。此外，貝勒醫(yī)學(xué)院（BCM）研究者同時使用第一代CAR-T和第二代CAR-T治療6例復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，加入CD28共刺激域的CAR-T細(xì)胞具有良好的增殖和持久性，輸注后的2周內(nèi)二代CAR分子的T細(xì)胞擴(kuò)增超過6倍，輸注后4-6周擴(kuò)增降到最低點，并且在體外TCR再刺激可再次迅速擴(kuò)增，顯示了CAR-T共刺激的重要性。臨床收益不大，2例患者獲得3-10個月的疾病穩(wěn)定，所有患者最終疾病進(jìn)展。
4-1BB vs. CD28共刺激域：持續(xù)性和復(fù)發(fā)
廣泛應(yīng)用于臨床的第二代CD19-CAR-T共刺激域為CD28或4-1BB（表1）。通過幾項研究，4-1BB共刺激域的CAR-T持久性似乎更久。迄今為止，4-1BB共刺激域（相對于CD28）的CD19-CAR-T治療兒童B-ALL獲得MRD-的完全緩解率似乎更高（表1）。盡管有這種趨勢，但無論是結(jié)合了4-1BB還是CD28共刺激域的CAR-T細(xì)胞與這些患者長期的OS和EFS的相關(guān)性仍不清楚。獲得CR（接受MSKCC的19-28ζ CAR T治療的37例成人患者中有18例CR，接受CHOP/UPenn的CTL019治療的50例兒童患者中有20例CR）后復(fù)發(fā)率可能相近，盡管成人患者與兒童患者之間的差異可能使對比更加復(fù)雜化。CTL019治療后的B-ALL患者復(fù)發(fā)會出現(xiàn)B系再生障礙的消失，這一情況的復(fù)發(fā)多為CD19+或CD19-的逃逸變異。相比之下，CD19-復(fù)發(fā)在19-28ζ CAR-T治療后通常少一些。MSKCC和FHCRC的CD19-CAR-T治療的成人B-ALL復(fù)發(fā)率類似，F(xiàn)HCRC組治療的患者獲得MRD-完全緩解率仍不清楚，而FHCRC治療成人患者復(fù)發(fā)率高，這可能反應(yīng)患者接受Cy淋巴細(xì)胞刪除預(yù)處理不充分，患者體內(nèi)對鼠源的scFv產(chǎn)生免疫應(yīng)答，早期數(shù)據(jù)表明Flu可能會克服這一限制。
截至目前，患有CLL和B-NHL的混合組對基于共刺激域的比較造成了干擾。在NCI，UPenn和FHCRC小組中，惰性侵襲性B-NHL患者在接受CD19-CAR-T治療后觀察到令人印象深刻的應(yīng)答反應(yīng)，并且哪個共刺激域的具有優(yōu)勢并不明顯。
淋巴細(xì)胞刪除
淋巴細(xì)胞刪除性化療可通過消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞提高CAR-T細(xì)胞應(yīng)答，清除其他免疫細(xì)胞來爭奪細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的活化。第一代CAR-T細(xì)胞可能是淋巴細(xì)胞缺失以及共刺激信號缺乏，以致抗腫瘤臨床療效受限，此外，MSKCC的早期研究中，對嘌呤類似物耐藥的CLL和巨大淋巴病變的患者進(jìn)行19-28ζCAR-T治療，3例患者在沒有進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除性化療預(yù)處理的情況下接受1.2-3.0x107 19-28ζCAR T-細(xì)胞/kg治療，結(jié)果沒有出現(xiàn)客觀應(yīng)答。隨后4例患者進(jìn)行1.5-3.0 g/m2的Cy預(yù)處理后接受0.4-1.0x107CAR T細(xì)胞/kg,1例患者外周淋巴結(jié)顯著減小，其他2例患者疾病穩(wěn)定。
BCM的研究者從靶向CD19特異性T細(xì)胞I期臨床試驗中推測出不充分的淋巴細(xì)胞刪除性化療可能會限制CAR-T的持久性。簡單地說，他們對8例B細(xì)胞惡性腫瘤患者在異基因造血干細(xì)胞移植后進(jìn)行供體來源的表達(dá)靶向CD19 CAR的病毒特異性T細(xì)胞（EMV,EBV,腺病毒）。沒有進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除性化療預(yù)處理。在輸注后的6周內(nèi)未發(fā)現(xiàn)IL-6，TNF-α或IFN-γ水平的增高，在CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的觀察中，6例可評估患者有2例在輸注后6周內(nèi)出現(xiàn)明顯的客觀應(yīng)答。在輸注后的1-12周通過qPCR檢測到的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)信號水平低下，流式細(xì)胞術(shù)未檢測到CAR，2例EBV復(fù)發(fā)的患者擴(kuò)增更明顯。
如前文所述，F(xiàn)HCRC的研究者在成人B-ALL和B-NHL研究中發(fā)現(xiàn)，充分的淋巴細(xì)胞刪除性化療預(yù)處理可防止轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的免疫排斥。在CAR-T細(xì)胞輸注后28天，F(xiàn)lu與Cy預(yù)處理的患者比單獨使用Cy預(yù)處理的患者具有更高的CAR-T表達(dá)水平（55.8 vs 0.1CD8+CAR-T細(xì)胞/ml，2.1 vs 0.02CD4+ CAR-T細(xì)胞/ml）。對Flu+Cy預(yù)處理組也進(jìn)行了提高無疾病生存率的觀察。在對成人B-NHL的觀察中使用Flu+Cy的患者比單獨使用Cy的患者CAR-T峰值水平更高。（31.9 vs 0.55CD8+CAR-T細(xì)胞/ml，16.5 vs 0.31CD4+ CAR-T細(xì)胞/ml）。
NCI研究者最新報道了20例接受同種異體造血干細(xì)胞治療的B細(xì)胞惡性腫瘤患者（B-NHL10人，B-ALL5人，CLL5人）接受CD28共刺激域同種異體CD19-CAR-T劑量遞增(0.4-8.2x106/kg)治療情況。盡管沒有進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除性化療，有8例患者出現(xiàn)明顯的客觀應(yīng)答。值得注意的是，5例B-ALL患者有4例獲得具有正常B細(xì)胞克隆的MRD-的完全緩解。在CR和PR患者中通過qPCR可檢測到CAR的高表達(dá)。非ALL和DLBCL患者入組前需接受至少1次供者淋巴細(xì)胞輸注（DLI），出現(xiàn)≤1級的急性移植物抗宿主（GVHD）或≤中級慢性GVHD有入組資格，所有患者沒有出現(xiàn)新的GVHD。沒有進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除預(yù)處理的復(fù)發(fā)性B-ALL患者在輸注CAR-T后獲得的客觀反映仍然引人注目。觀察到的活性反應(yīng)得益于天然的同種異體應(yīng)答反應(yīng)，應(yīng)答者沒有發(fā)生GVHD并且B-ALL患者對DLI出現(xiàn)應(yīng)答率低說明抗白血病活性主要為靶向同種異體抗原的免疫應(yīng)答。在此試驗方案中淋巴細(xì)胞刪除預(yù)處理能否進(jìn)一步增強(qiáng)同種異體CAR-T的活性尚不清楚。
CAR-T劑量
如表1所述，大部分輸注CAR-T的劑量范圍寬泛，有時使用劑量遞增方案。一些報道中提出CAR-T輸注劑量和CRS發(fā)生率和嚴(yán)重性具有相關(guān)性，多項CRS的DLT研究正在進(jìn)行。如前所述，由于細(xì)胞劑量與CRS的關(guān)聯(lián)，我們制定高疾病負(fù)荷的使用低劑量細(xì)胞而MRD患者使用高劑量細(xì)胞（1x106 vs. 3x106 19-28z CAR-T細(xì)胞/kg），MRD患者對高劑量CAR-T細(xì)胞耐受良好。在之前我們觀察到MRD相對于高疾病負(fù)荷B-ALL患者體內(nèi)CAR-T擴(kuò)增較弱，說明這些患者在固定劑量的CAR-T細(xì)胞下接受的有效劑量相對較低。然而，MRD患者接受高劑量會產(chǎn)生更大功效尚不明確。在對兒童B-ALL，成人B-ALL，CLL和B-NHL研究中，對劑量遞增計劃和隨機(jī)劑量的答進(jìn)行比較，沒有發(fā)現(xiàn)高劑量與高功效和持久性具有顯著的相關(guān)性。目前在這些報道中樣本量尚小，有效的CAR-T劑量和組份以及療效與毒性間的平衡關(guān)系仍不明確。
討論
復(fù)發(fā)難治B細(xì)胞惡性腫瘤的CD19-CAR-T治療是一個非常有效的治療方法。盡管在共刺激域，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和輸注CAR-T細(xì)胞的劑量上存在差異，但這些差異沒有對應(yīng)答率和持久性產(chǎn)生重大影響。所有這些研究都關(guān)注于療效的常見關(guān)鍵因素：腫瘤的特異性和通用靶標(biāo)，淋巴細(xì)胞刪除性化療，第二代CAR，短期培養(yǎng)的T細(xì)胞擴(kuò)增。然而，因缺乏隨機(jī)試驗，給不同CAR結(jié)構(gòu)間的客觀比較帶來難度。
在此期間，從目前的研究中我們?nèi)〉昧艘恍┙?jīng)驗。首先，取代傳統(tǒng)化療和小分子抑制劑中“劑量統(tǒng)一”的方案，最佳療效和安全劑量取決于CAR-T治療前疾病負(fù)荷（至少在B-ALL中），淋巴細(xì)胞刪除性化療和疾病類型（ALL vs. CLL/NHL）。接下來進(jìn)行的臨床試驗確定劑量遞增方案時應(yīng)考慮這些因素。其次，所有靶向CD19的CAR會出現(xiàn)一定程度的CRS和神經(jīng)毒性。不過，在我們可以比較各種治療的毒性作用前，當(dāng)務(wù)之急是建立CAR-T治療相關(guān)的CRS和神經(jīng)毒性的統(tǒng)一定義標(biāo)準(zhǔn)。第三，仍然沒有CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增和持久性的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。雖然qPCR更為靈敏，但它的結(jié)果與似乎更具有特異性的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果不總是相匹配。因此，今后的試驗應(yīng)優(yōu)化可衡量CAR-T臨床相關(guān)持久性的最佳檢測方法。
Is one CAR best?由于本綜述著重凸顯試驗設(shè)計的差異，在此無法回答這個問題。下面再開展的臨床試驗可能在相同類型的患者中比較不同的CAR篩選出最優(yōu)者。此外，除CD19外靶向其他靶點的CAR正進(jìn)行臨床評估，優(yōu)化CAR-T細(xì)胞技術(shù)，提高T細(xì)胞的持久性并突破腫瘤微環(huán)境，是CAR-T治療其他腫瘤取得顯著成效的關(guān)鍵。
