免费视频淫片aa毛片_日韩高清在线亚洲专区vr_日韩大片免费观看视频播放_亚洲欧美国产精品完整版

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫，目前所發(fā)現(xiàn)的miRNAs已超過700個(gè)，隨著高通量測序的應(yīng)用，將會(huì)有更多的新的miRNAs被發(fā)現(xiàn)?？赡芙?0%的人類基因受到miRNAs調(diào)控，然而，當(dāng)過表達(dá)或抑制某一個(gè)miRNA時(shí)，在發(fā)生調(diào)變的眾多基因當(dāng)中尋找并鑒定其中起關(guān)鍵作用的靶基因仍然具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測，結(jié)合基因芯片分析以及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來研究miRNA的功能及尋找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

1. Northern雜交

   MicroRNA是一類很小的分子，部分microRNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究有一定困難，特別是重復(fù)性較差，步驟繁瑣等。目前多數(shù)研究人員采用Northern Blot，它是一種重復(fù)性好、靈敏高、直接的方法,可以用來檢測microRNA的存在、表達(dá)量的變化等。而由于放射污染等原因，同位素標(biāo)記的探針的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的鎖核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探針，具有穩(wěn)定性高、特異性好、無放射污染等優(yōu)點(diǎn)，成為新的Northern Blot檢測探針。

   基本原理：將待檢測的RNA分子變性后，通過尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，固定后再與同位素、地高辛或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。

   用途：檢測樣品中的RNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

   實(shí)驗(yàn)過程

   1. 提前配制無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠的混合液，即

      50ml of Pre-Gels：

      1. Urea: 24 g
      2. 40% Acrylamide: 18.75 mL
      3. 5x TBE Buffer: 10 mL
      4. ddH20: 0 mL
   2. 器皿的清洗：器皿同Western Blotting裝置。
      1. 用清水沖洗干凈，乙醇擦干3%；
      2. H2O2 填充浸泡電泳槽、玻璃片、梳子10分鐘；
      3. 用0.1% DEPC處理過的水沖洗電泳槽，梳子和玻璃片。
      4. 用RNAase Away 擦海綿和其他相關(guān)器材。
      5. 安裝配膠裝置。
   3. 配膠：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混勻，加入玻片中，加入10或15齒梳子。大約30-60 min 即可凝好。
   4. RNA樣品的準(zhǔn)備

      Small RNAs（大約107細(xì)胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加熱 5min, 冰上冷卻。 瞬時(shí)離心收集RNA樣品。

   5. 電泳：（裝置同Western Blotting電泳裝置），電泳液1xTBE。

      15% Urea-PAGE 在電泳液 1xTBE進(jìn)行電泳。電壓180V 直到溴芬蘭到達(dá)膠的底部。根據(jù)Ambion公司的步驟，在上樣之前，300V 預(yù)電泳10min（防止膠漏同時(shí)活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。選用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作為對(duì)照，同時(shí)將自己合成的RNA Oligo作為陽性對(duì)照（總量為1 pmol即可）。其中溴芬蘭的對(duì)應(yīng)的分子量為13nt左右，二甲苯青FF對(duì)應(yīng)的為40 nt左右。

   6. 轉(zhuǎn)膜（裝置同Western Blotting轉(zhuǎn)膜裝置），轉(zhuǎn)膜液為0.5?TBE。
      1. 將膠浸泡在0.5?TBE大約 10min 。
      2. 用EtBr （0.5ug/ml）染膠10min 后，用紫外凝膠觀測RNA電泳情況(參考Ambion公司的條帶分析)。用0.5?TBE 洗膠 5min.
      3. 用鉛筆標(biāo)記好轉(zhuǎn)膜的面，將 Nylon membrane（GE公司）和兩片厚濾紙浸泡在 0.5?TBE 大約10min.
      4. 制備凝膠、膜夾層。將濾紙、膠、膜、濾紙形成三明治結(jié)構(gòu)，注意膠應(yīng)該靠近陰極側(cè)。注意每層間不能有氣泡。
      5. 裝配好轉(zhuǎn)膜裝置，裝置同Western Blotting轉(zhuǎn)膜裝置。
      6. 于冰上300mA轉(zhuǎn)膜 1 h。
      7. 把膜（RNA 面朝上）放在紫外交聯(lián)儀中使用4000J UV進(jìn)行交聯(lián).
      8. 將膜夾在厚的濾紙中間，80℃烘烤0.5-2 h，可以輕壓，以防止膜發(fā)生翻卷。
      9. 如果可以直接做，則放在室溫即可；也可以儲(chǔ)存在4?C ，直到使用（可儲(chǔ)存6個(gè)月）。
      10. 亞甲藍(lán)（methylene blue）染色 3~5min, 在可見光下 黃色濾光片對(duì)膜照相。
   7. 雜交
      1. 在雜交爐中37- 42℃ 在雜交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中預(yù)雜交1h , 然后將膜放入雜交袋，然后加入配好濃度的Dig-Labeled probe，在雜交爐中37- 42℃雜交過夜。

         Dig-Labeled probe使用濃度：將10ul的25uM的公司原液稀釋十倍后分裝儲(chǔ)存，取儲(chǔ)存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6內(nèi)參）或2.7-27ul儲(chǔ)存液/10ml雜交液（根據(jù)miRNA的量或豐度定）。

      2. 37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。
      3. 室溫MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。
      4. 室溫用Blocking Solution (用MAB 10倍稀釋10×Blocking Solution)封閉 1h 。
      5. 室溫加入anti-Dig antibody 40 min (1:10000-1:5000 in Blocking Solution)。注意：抗體用之前，應(yīng)該以12000g速度離心5 min。
      6. 用MABT液洗膜兩次，每次15 min。
      7. 膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。
      8. 配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入雜交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，擠出氣泡，封口，孵育5 min.
      9. 擠出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。
      10. 曝光2 min~1h (根據(jù)情況定)。一般內(nèi)參U6在5分鐘內(nèi)即可顯影。

   實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

   1. 配膠時(shí)，由于濃度較大，所以尿素比較難溶，尿素的溶解不能加熱，可以采用振蕩或顛倒離心管；配好的無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠可以儲(chǔ)存在室溫或4℃冰箱中（可儲(chǔ)存1個(gè)月左右）。
   2. 電泳前，應(yīng)該按照步驟將裝置盡量進(jìn)行RNAase free處理。
   3. RNA上樣前，300V 預(yù)電泳10min（防止膠漏，同時(shí)活化膠），然后用電泳液 1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。此操作需要一定的訓(xùn)練，因?yàn)榧訕涌字泻芸鞎?huì)析出尿素，一旦有尿素析出對(duì)RNA電泳的形態(tài)會(huì)有一定的影響。
   4. LNA探針使用前進(jìn)行分裝，然后凍存于-70℃冰箱中。
   5. 不同miRNA雜交的溫度和時(shí)間不同，需要進(jìn)行條件的摸索。一般內(nèi)參溫度 為42℃。
   6. 尼龍膜紫外交聯(lián)和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

2. 原位雜交

   原位雜交分為細(xì)胞和組織內(nèi)原位雜交，該技術(shù)檢測miRNA表達(dá)，可更直觀的展示出miRNA的時(shí)空表達(dá)模式。它不僅可以檢測不同細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞中的miRNA表達(dá)，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平。它是分析miRNA表達(dá)組織和時(shí)序特異性的有力工具。

3. Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR

   傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量RT PCR只能檢測到miRNA前體，而Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR技術(shù)可以解決這一問題。Stem loop實(shí)時(shí)定量RT PCR是一項(xiàng)高特異度、敏感度的檢測miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括設(shè)計(jì)具有莖環(huán)（stem loop）結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 二個(gè)關(guān)鍵步驟。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):高度特異性，對(duì)序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總RNA；適用范圍廣，總RNA 、細(xì)胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測。

   Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，這種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物針對(duì)所需檢測的目的microRNA設(shè)計(jì)，具有特異的序列，結(jié)構(gòu)示意圖如下所示。內(nèi)參使用的是小RNA U6，U6的反轉(zhuǎn)錄使用的是隨機(jī)引物。將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為real-time PCR的模板，檢測目的microRNA的引物是針對(duì)目的microRNA的特異的上下游引物，檢測內(nèi)參使用的是針對(duì)U6的特異的上下游引物。

   實(shí)驗(yàn)過程

   1. 用Trizol抽提t(yī)otal RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用異丙醇處理時(shí)需要4℃ 過夜。將抽提得到的RNA置于－80℃保存。
   2. 將抽提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的體系一般使用12.5ul的體系。具體的體系如下：
      1. RNase free water
      2. Total RNA: 0.625ug
      3. Impron buffer: 2.5ul
      4. dNTPs: 2.5ul
      5. RNase inhibitor: 0.625ul
      6. Impron Mgcl2: 1.5ul
      7. Primer: 0.5ul
      8. Reverse transcriptase: 0.625ul

      具體的操作是事先計(jì)算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并將剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反轉(zhuǎn)錄的體系做好總的MIX，再分裝到每個(gè)PCR小管內(nèi)。將PCR小管置于PCR儀上反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)的具體程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃儲(chǔ)藏

   3. 反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為real-time PCR檢測的模板，由于real-time PCR檢測靈敏性，要求每個(gè)樣需要三個(gè)重復(fù)。每一個(gè)反應(yīng)的用量如下：
      • SYBR 5.0ul
      • Primer mix 0.2ul
      • cDNA 1.0ul
      • water 3.8ul
   4. 在八連管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。
   5. 根據(jù)需要檢測樣本的個(gè)數(shù)，計(jì)算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具體的計(jì)算過程為：試劑單反應(yīng)量X檢測樣本個(gè)數(shù)X3.4 ,根據(jù)計(jì)算需要的量制作MIX 。將MIX加入每個(gè)八連管的小管中。
   6. 將對(duì)應(yīng)的每個(gè)八連管的小管取出10ul加入96孔板，每個(gè)小管對(duì)應(yīng)96孔板的3個(gè)孔，即3個(gè)重復(fù)孔。
   7. 加完樣品后，用專用的封膜覆蓋96孔板，用專用的刮板覆蓋嚴(yán)實(shí)。
   8. 上機(jī)檢測。具體PCR程序如下：
      1. 50℃ 2 min ;
      2. 95℃ 5 min ;
      3. 95℃ 30 s ;
      4. 60℃ 40 s ;
      5. 72℃ 30 s ;
      6. 95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>

         實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

         1. 由于real-time PCR的檢測十分靈敏，因此它對(duì)RNA定量的準(zhǔn)確性要求較高，一般RNA的定量多采用3復(fù)孔定量。
         2. 無論在反轉(zhuǎn)錄或real-time PCR加樣時(shí)要求加樣一定要準(zhǔn)確。
         3. 在將八連管的mix加入96孔板前一定要充分混勻，一般采取的策略是將八連管一剪為二，置于Vortex上振蕩混勻，Vortex的轉(zhuǎn)速不要太高，以免將管內(nèi)的液體濺到蓋子內(nèi)。