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肝癌（HCC）是一種常見的惡性腫瘤，與病毒感染，代謝疾病等密切相關(guān)。肝癌具有高復(fù)發(fā)性以及異質(zhì)性，肝癌干細(xì)胞可能參與肝癌的兩大組織學(xué)特性，但具體機(jī)制尚未可知。

首先，作者通過轉(zhuǎn)錄組芯片鑒定了人肝癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)有286 非編碼RNA 在人肝癌干細(xì)胞中異常表達(dá) (Figure 1A)。

由于lncRNAs一般作用于臨近基因。作者重點(diǎn)尋找位于干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或者與干細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)編碼基因臨近的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)lncTCF7在人肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)，且位于人類第五號(hào)染色體，介于HSPA4與TCF7基因間 (Figure 1B)。

作者進(jìn)一步證實(shí)lncTCF7在人肝癌干細(xì)胞系以及三株肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)(Figure 1C- 1E)。

同時(shí)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lncTCF7在肝癌標(biāo)本中顯著高于正常組織與肝硬化組織(Figure 1F）。

然后作者進(jìn)行northern blot發(fā)現(xiàn)lncTCF7長(zhǎng)度介于500-1000bp之間(Figure 1G)。通過RNA-FISH與細(xì)胞分流實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)lncTCF7 定位于肝癌細(xì)胞核中 (Figures 1H and 1I)。

作者通過慢病毒SHRNA的方式敲減肝癌干細(xì)胞中lncTCF7 的表達(dá)(Figure 2A)，發(fā)現(xiàn)lncTCF7 的敲減顯著顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞重要干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2 、Nanog、Oct4的表達(dá)(Figure 2B)。敲減lncTCF7，不僅顯著減少CSCs的形成 (Figure 2C)，更重要的是，lncTCF7的缺失損害體外干細(xì)胞小球的形成能力(Figure 2D)。

在肝癌細(xì)胞系中敲減lncTCF7 的表達(dá)，肝癌細(xì)胞重要干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2 、Nanog的表達(dá)也顯著降低(Figure 2E)。然后作者在裸鼠皮下接種穩(wěn)定敲減lncTCF7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲減lncTCF7抑制腫瘤形成 (Figure 2F)，腫瘤的自我更新能力以及腫瘤增殖也受到抑制(Figures 2G and2H)。

作者通過構(gòu)建LncTCF7穩(wěn)定高表達(dá)肝癌細(xì)胞系（Figure 3A），發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)了肝癌干細(xì)胞的自我更新能力(Figure 3B)。腫瘤成球能力以及腫瘤形成能力增強(qiáng) (Figures 3C and 3D)。lncTCF7 過表達(dá)顯著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)(Figure 3E) 以及腫瘤發(fā)生頻率 (Figure 3F)。

以上實(shí)驗(yàn)證明lncTCF7 在肝癌干細(xì)胞腫瘤自我更新能力中起到重要作用

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探究機(jī)制

作者通過對(duì)lncTCF7敲減細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證TCF7 編碼基因以及Wnt信號(hào)通路靶基因顯著下調(diào)(Figure 4A -4C)。lncTCF7過表達(dá)顯著上調(diào)TCF7編碼基因以及Wnt信號(hào)通路靶基因。提示lncTCF7主要通過調(diào)控TCF7而活化Wnt信號(hào)通路。

為了驗(yàn)證lncTCF7主要通過調(diào)控TCF7參與腫瘤自我更新能力，作者在lncTCF7敲減細(xì)胞株中進(jìn)行了TCF7的挽救實(shí)驗(yàn)(Figure 4E)，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞小球的形成能力恢復(fù)(Figure 4F)。

為了探究TCF7在肝癌中的臨床意義，作者發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，TCF7在肝癌腫瘤中高表達(dá)(Figure 4G)。此外發(fā)現(xiàn)TCF7主要定位于肝癌細(xì)胞核內(nèi)(Figure 4H and 4I)。TCF7的高表達(dá)，患者五年生存率降低(Figure 4J)。

以上實(shí)驗(yàn)證明lncTCF7 調(diào)控TCF7 的表達(dá)參與激活Wnt信號(hào)通路,導(dǎo)致肝癌干細(xì)胞的自我更新作用增強(qiáng)，加快腫瘤進(jìn)程

作者通過RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)尋找lncTCF7結(jié)合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)lncTCF7可以結(jié)合SWI/SNF復(fù)合體三個(gè)重要組成部分：BRG1, BAF170, SNF5(Figures 5A and 5B)。其中lncTCF7與SWI/SNF 復(fù)合體的結(jié)合經(jīng)RNA免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)(Figure 5C)。

然后作者進(jìn)行一系列的lncTCF7的截?cái)嗄Ｐ蛯ふ遗cSWI/SNF復(fù)合體結(jié)合位點(diǎn)(Figure 5F)，發(fā)現(xiàn)lncTCF7 3’端468至683位點(diǎn)能夠結(jié)合BAF170, BRG1, SNF5 (Figure 5F)，并且通過EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)與BAF170的結(jié)合 (Figures 5G and 5H)。

以上結(jié)果證明，lncTCF7可以招募結(jié)合SWI/SNF復(fù)合物

由于SWI/SNF復(fù)合物可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)重塑。作者發(fā)現(xiàn)lncTCF7的敲減可以抑制BAF170與TCF7啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合(Figure 6A)。熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)1,200-1,100 bp是BAF170與TCF7啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合所需位點(diǎn)(Figures 6B–6D)。研究發(fā)現(xiàn)BAF170缺失可以導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞Nanog基因的表達(dá)下調(diào)(Figure 6G)，同時(shí)下調(diào)WNT下游基因Sox2,CCND1以及CCND2的表達(dá)。BAF170的敲減也顯著降低腫瘤形成能力以及抑制腫瘤生長(zhǎng)（Figures 6I–6K)。

綜上所述，lncTCF7通過招募SWI/SNF復(fù)合物，激活Wnt信號(hào)通路，在肝癌干細(xì)胞自我更新的維持中發(fā)揮重要作用

最后，通過模式圖回顧一下lncTCF7調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新機(jī)制: lncTCF7通過招募SWI/SNF復(fù)合物，結(jié)合在TCF7啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)TCF7基因的轉(zhuǎn)錄，激活Wnt信號(hào)通路，在肝癌干細(xì)胞自我更新的維持中發(fā)揮重要作用。

研究提示lncRNA可以作為肝癌發(fā)生發(fā)展的重要分子，可能將成為腫瘤臨床干預(yù)的重要新靶點(diǎn)。