基因治療流程及分類
基因作為遺傳物質(zhì)的基本單位，具有控制遺傳性狀表達和活性調(diào)節(jié)的作用。基因治療可以通過基因轉(zhuǎn)移或基因調(diào)控等方法，將帶有治療性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，糾正或補償異?；蛉毕菀赃_到治療疾病的目的。
基因治療的流程分為：目的基因制備、載體構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、外源基因表達和檢測。
★ 目的基因制備：確定用于治療疾病的目的基因
★ 載體構(gòu)建：載體負責(zé)將外源基因運輸?shù)郊毎麅?nèi)，載體分為病毒載體和非病毒載體
★ 細胞轉(zhuǎn)染：基因可通過病毒感染、物理方法、化學(xué)方法等導(dǎo)入靶細胞，目前轉(zhuǎn)染率無法達到100%，需進行篩選（標記基因篩選法、基因缺陷型受體細胞的選擇性、基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)）
★ 外源基因表達和檢測：鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中外源基因的表達狀況。其中包括對目的基因和標記基因表達的鑒定（原位雜交、Northern雜交、NRA打點雜交、免疫組化染色）
基因治療可根據(jù)實現(xiàn)手段的不同分為離體治療和體內(nèi)治療兩大類。疾病產(chǎn)生部位、體內(nèi)細胞的獲取難度等因素共同決定了是采用體內(nèi)方法還是體外方法。
★ 離體基因治療：從患者體內(nèi)分離細胞，將整合載體在體外導(dǎo)入這些細胞，進行基因工程改造，隨后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。需要采集患者的細胞進行處理后再回輸，因此難以規(guī)范化生產(chǎn)，主要針對血液病，如治療β地中海貧血的Zynteglo
★ 體內(nèi)基因治療：分為基因替代（補充治療性基因）和基因編輯（敲除或糾正錯誤基因）。將非整合載體直接注射給患者，使得功能性矯正基因被遞送至患者體內(nèi)，恢復(fù)疾病正常表型
兩者各有其優(yōu)缺點。離體基因治療利用自體細胞，不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)；同時還可在體外篩選到高效轉(zhuǎn)導(dǎo)以及無脫靶的細胞，但有制備步驟繁瑣，細胞活力低等缺點。在體基因治療操作簡便，對于一些體外無法培養(yǎng)的細胞類型是最優(yōu)選擇。但由于體內(nèi)編輯的不確定性，無法避免很多隨機整合或脫靶等事件，并且一些病毒載體還會使機體出現(xiàn)危及生命的免疫反應(yīng)。
基因治療的2種方式（體外-左；在體-右）
基因治療載體的選擇
基因?qū)胂到y(tǒng)（gene delivery system）是基因治療的核心技術(shù)，載體的選擇是基因治療成敗的關(guān)鍵。理想的載體需具備以下特點：
★ 有足夠的空間來遞送大片段的治療基因
★ 具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能感染分裂和非分裂的細胞
★ 能靶向特定的細胞，且可以長期穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因
★ 具有較低的免疫原性的或致病性，不會引起炎癥
★ 具備大規(guī)模生產(chǎn)的能力
基因治療載體一般分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)，病毒是最常用的基因載體。目前最為常用的病毒載體包括腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、腺病毒（Adenovirus，AdV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus，RV）等，其他還有單純皰疹病毒載體、豆苗病毒載體、溶瘤病毒載體等；非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、質(zhì)粒等。
2018 年基因治療管線中載體使用情況
已上市基因治療藥物
1. Gendicine（今又生）是全球首個獲批的基因治療藥物，由深圳賽百諾開發(fā)，用于治療攜帶p53基因突變的腫瘤患者。Gendicine是一種攜帶野生型p53基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，可通過刺激腫瘤細胞中的凋亡途徑，增加腫瘤抑制基因和免疫應(yīng)答因子的表達進而殺傷腫瘤。CFDA于2003年10月批準了Gendicine用于頭頸部鱗狀細胞癌的治療。
2. Oncorine（安柯瑞）是另一種攜帶p53基因治療頭頸癌的基于復(fù)制缺陷ADV的藥物，于2005年在中國上市，由上海三維生物開發(fā)。Oncorine是通過重組的方式刪除人5型腺病毒E1B-55kD和E3區(qū)部分基因片段而獲得的一種溶瘤性腺病毒，它可在p53功能缺陷的腫瘤細胞中選擇性復(fù)制而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡，而不會對正常細胞產(chǎn)生明顯毒副作用。
3. Rexin-G是一種嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，裝載有細胞殺傷性顯性負性的細胞周期蛋白G1基因以靶向并殺死實體腫瘤，于2005年獲得菲律賓FDA的批準。
4. Neovasculgen 2012年，俄羅斯批準Human Stem Cell Institute的產(chǎn)品Neovasculgen上市，用于治療末梢血管病和肢體缺血。
5. Glybera是由UniQure公司研發(fā)的的脂蛋白酶缺乏癥(LPLD)基因療法，它2012年10月獲得歐盟藥物管理機構(gòu)批準，2014年正式上市，是第一個被歐盟批準上市的基因治療方法，推出時該藥物在德國的銷售成本約100萬美元/治療。2017年10月份Glybera的銷售許可證到期之前UniQure宣布不再重新申請銷售許可，該藥物因上市四年只有一人使用而退出市場。
6. Imlygic（T-VEC）2015年，F(xiàn)DA批準安進公司的溶瘤病毒療法Imlygic上市，該療法運用基因改造技術(shù)修飾單純皰疹病毒1，使其具有更強的腫瘤殺傷能力，用于治療病灶在皮膚和淋巴結(jié)且沒能通過手術(shù)完全清除的黑色素瘤，這是美國批準的第一個運用基因改造技術(shù)的產(chǎn)品。T-VEC在歐洲和澳大利亞已被批準用于黑色素瘤的治療。
7. Spinraza由百健(Biogen)與Ionis制藥公司合作開發(fā)，為首個批準用于治療罕見且致命的脊髓性肌萎縮癥（SMA）的治療方法。Spinraza是一種反義寡核苷酸（ASO），可改變SMN2基因的剪接，增加全功能性SMN蛋白的生產(chǎn)。Spinraza在國外的治療費用相當(dāng)昂貴，定價12.5萬美元/針，首年需要6次注射，治療費用為75萬美元，第二年的費用降低一半至37.5萬美元。該療法已于19年2月在國內(nèi)獲批。
8. Strimvelis是GSK研發(fā)的一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒用于治療超罕見的免疫缺陷綜合癥（ADA-SCID）的藥物，于2016年5月被EMA批準上市，定價59.4萬歐元。是第一個用于治療ADA-SCID的體外干細胞基因療法，也是第二個被歐盟批準上市的基因療法。Strimvelis通過從患者的骨髓中取出干細胞，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)將一個正常拷貝的ADA基因?qū)敫杉毎?，然后采取靜脈輸注將干細胞重新導(dǎo)入患者體內(nèi)，之后一部分干細胞會歸巢至骨髓。
9. Zalmoxis由意大利MolMed公司研發(fā)，是另一種基于供者來源T細胞的自殺基因免疫療法，于2016年被EMA有條件性批準用于治療部分白血病和淋巴瘤。該方法使用RV遺傳修飾異體來源的T細胞以表達1NGFR和HSV-TK Mut2自殺基因，因而可以隨時使用更昔洛韋（ganciclovir）藥物殺死引起不良免疫反應(yīng)的T細胞。帶有“自殺基因”的T細胞表達前藥轉(zhuǎn)換酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韋的細胞毒活性，從而誘導(dǎo)T細胞“自殺”，防止可能出現(xiàn)的GVHD進一步惡化。
10. Kymriah由賓夕法尼亞大學(xué)和諾華公司共同研發(fā)，是一種基于慢病毒的嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）來治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）和B細胞急性淋巴細胞白血?。ˋLL）患者的基因療法，于2017年8月被FDA批準上市。它使用患者自身重編程的T細胞編碼轉(zhuǎn)基因CAR來鑒定和消除表達CD19的惡性和非惡性腫瘤細胞，整體的治療緩解率可達83％。
11. Yescarta是另一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的CAR-T細胞免疫療法，由吉利德開發(fā)，于2017年10月獲得FDA批準。使用NHL患者自身T細胞并使用RV進行遺傳修飾以產(chǎn)生與CD28和CD3-zeta共刺激結(jié)構(gòu)域連接的抗CD19的CAR，以幫助對抗淋巴瘤。
12. Luxturna于2017年12月被FDA批準作為治療Leber先天性黑朦的孤兒藥，也是首個用于治療失明的基于病毒類的藥物。攜帶有野生型RPE65的AAV2被用于治療雙等位基因RPE65突變相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的患者，可在幾個月內(nèi)恢復(fù)視力。
13. Collategene 2019年2月，日本厚生勞動省在批準Kymriah的同時批準了本國公司AnGes生產(chǎn)的基因治療產(chǎn)品Collategene，用于治療在標準藥物治療后無效的閉塞性動脈硬化癥和血栓閉塞性脈管炎，這是被日本官方批準的第一款基因治療產(chǎn)品。
14. Zolgensma 2019年5月，F(xiàn)DA批準諾華旗下的AveXis 公司的Zolgensma，用于治療2歲以下兒童的脊髓性肌萎縮癥，Zolgensma的定價為每劑212.5萬美元，成為有史以來最昂貴的藥物。
15. Zynteglo是由Bluebird Bio開發(fā)的一款基于慢病毒的自體干細胞療法，于2019年6月獲得EMA有條件批準用于治療12歲及以上的非β0 /β0基因型輸血依賴性β-地中海貧血(TDT)患者。臨床數(shù)據(jù)顯示，該療法可以使特定基因型TDT患者免于輸血長達3.8年。
小結(jié)
★ 基因治療本質(zhì)上是一個目的基因、載體和轉(zhuǎn)染的問題，基因載體是基因治療成功的關(guān)鍵。安全性高，容量大，轉(zhuǎn)染效率高，長期穩(wěn)定表達的特異靶向性的新型載體，是基因載體研究的方向。
★ 基因藥物開發(fā)的費用不菲，評估其潛在價值比較困難，如何定價、誰來買單的問題難以解決。
★ 期待未來基因療法將從罕見病領(lǐng)域推廣至大病種，發(fā)揮更大的社會價值與資本收益。
參考文獻：
[1] 細胞和基因治療 CDMO， 下一個快速增長的新賽道，廣發(fā)證券
[2] Gene Therapy，The New England Journal of Medicine
[3] 2019年我國基因治療載體行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，火石創(chuàng)造
[4] 基因治療發(fā)展歷程概述與展望, 精準醫(yī)藥GETG
