造血腫瘤細(xì)胞播散是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。固體上皮腫瘤（例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌）患者的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè)具有遠(yuǎn)大的前景。對(duì)CTC的分子特性的了解在技術(shù)上目前仍具有挑戰(zhàn)。CTC特性的鑒別需要靈敏度和特異性極高的分析方法，這些方法通常會(huì)結(jié)合復(fù)雜的富集技術(shù)和檢測(cè)程序。CTC的濃度非常低，在數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的正常血細(xì)胞背景中存在一個(gè)腫瘤細(xì)胞。由于CTC上皮—間葉細(xì)胞的可塑性，所以現(xiàn)有CTC試驗(yàn)中使用上皮標(biāo)志物很難將其檢測(cè)出來(lái)。在本篇文章中，我們總結(jié)了當(dāng)前用于富集和檢測(cè)CTC的方法并討論了在改善臨床癌癥患者管理的環(huán)境中CTC分析的前景和關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
癌癥患者外周血CTC檢測(cè)具有遠(yuǎn)大前景但仍具有技術(shù)上的挑戰(zhàn)。在過(guò)去的幾年中，人們對(duì)CTC領(lǐng)域的興趣顯著增加并快速開(kāi)發(fā)了許多新技術(shù)來(lái)鑒別CTC。
CTC的濃度非常低，在數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的正常血細(xì)胞背景中存在一個(gè)腫瘤細(xì)胞。CTC的鑒別和特性分析因此需要靈敏度和特異性極高的分析方法。這些方法通常會(huì)結(jié)合富集和檢測(cè)程序。由于罕見(jiàn)事件的檢測(cè)總是受到泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)的阻礙，因此最好用大血量（至少7.5mL或更多）分析，具有CTC負(fù)荷小的早期癌癥患者人群尤其需要大血量分析。
CTC研究的目標(biāo)包括（i）癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)或進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估（即：預(yù)后信息）；（ii）療法的分層和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；（iii）治療靶點(diǎn)和耐藥性機(jī)制的鑒別；（iv）癌癥患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移發(fā)展的理解。
這篇文章側(cè)重于當(dāng)前CTC監(jiān)測(cè)和特性分析方法學(xué)的挑戰(zhàn)和前景，可能有助于癌癥患者個(gè)性化靶向治療的改進(jìn)。
CTC富集包括大范圍基于不同CTC特性的技術(shù)，這些技術(shù)必須能將其從正常造血細(xì)胞中區(qū)分出來(lái)：（i）物理特性（例如：大小、密度、電荷和可變形性）；（ii）生物特性（例如表面蛋白表達(dá)和侵潤(rùn)能力）（圖1）。
物理特性能讓區(qū)分工作在不使用標(biāo)記的條件下進(jìn)行（i）密度梯度離心（Ficoll OncoQuickTM），已知一定數(shù)量的CTC會(huì)在系統(tǒng)中丟失；（ii）通過(guò)特殊過(guò)濾器過(guò)濾，ISET（根據(jù)上皮腫瘤細(xì)胞的大小來(lái)分離）或一種新型三維微型過(guò)濾器，會(huì)丟失小的CTC，過(guò)濾器孔會(huì)保存大的造血細(xì)胞；（iii）新型通用無(wú)標(biāo)記生物芯片，該方法利用癌細(xì)胞與血細(xì)胞在大小（更大）和可變形性（更硬）上的獨(dú)特差異；（iv）結(jié)合多孔流分離（MOFF）和介電泳（DEP）細(xì)胞分離技術(shù)的微流體設(shè)備；（v）介電泳場(chǎng)流分離（DEP-FFF）設(shè)備，根據(jù)大小和膜特性的不同導(dǎo)致對(duì)DEP的反應(yīng)不同進(jìn)行活CTC分離。
生物學(xué)特性主要應(yīng)用于免疫程序，這些程序使用對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原（陽(yáng)性選擇）或白細(xì)胞共同抗原CD45（陰性選擇）的抗體。免疫磁性系統(tǒng)用磁珠偶聯(lián)抗體靶定抗原，接著抗原抗體復(fù)合物受到磁場(chǎng)效應(yīng)被分離。通過(guò)上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）抗體執(zhí)行陽(yáng)性選擇，然后使用細(xì)胞角蛋白（CK）—上皮細(xì)胞中間纖絲的抗體執(zhí)行CTC免疫細(xì)胞檢測(cè)。當(dāng)前基于EpCAM的技術(shù)中，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的CellSearchTM系統(tǒng)在過(guò)去的7年中得到了廣泛的關(guān)注，該系統(tǒng)經(jīng)常用于與所有新型CTC檢測(cè)方法比較。近來(lái)還研發(fā)了其他有前景的使用不同方法捕獲EpCAM陽(yáng)性CTC的技術(shù)，這些技術(shù)包括：（i）一種稱為CTC芯片的微流體平臺(tái)，該平臺(tái)由anti-EpCAM抗體包被微柱陣列組成，用于分析患有實(shí)體瘤患者的血液樣品。癌癥患者甚至是非轉(zhuǎn)移癌癥患者的CTC計(jì)數(shù)很高，健康對(duì)照組陽(yáng)性事件的頻繁檢測(cè)表明了該試驗(yàn)的特異性需要進(jìn)一步研究。（ii）高通量微流體混合設(shè)備，又稱為魚(yú)骨狀芯片或“HB-芯片”，能提供先進(jìn)的CTC分離平臺(tái)；（iii）一種稱為“Ephesia”的CTC芯片，該芯片使用磁捕集器陣列中微流體通道內(nèi)自組合的生物功能化超順磁珠微柱；（iv）使用微流體系統(tǒng)對(duì)低豐度CTC進(jìn)行高通量選擇、計(jì)算和電動(dòng)處理；（v）其他新的免疫磁性分離技術(shù)有MagSweeper，從血液中積極富集表達(dá)EpCAM的循環(huán)上皮細(xì)胞（CepC），并支持后續(xù)分子分析；（vi）通過(guò)使用3D納米結(jié)構(gòu)底物或納米“Fly Paper”技術(shù)，可以有效地和特異性地捕獲包被有anti-EpCAM Ab-CTCs的硅納米線（SiNW）陣列；（vii）一種像魔術(shù)貼（Velcro-like）的微流體設(shè)備，該設(shè)備可以分離CTC，有效性范圍40%-70%。這并不是全部現(xiàn)有的試驗(yàn)，只是強(qiáng)調(diào)了現(xiàn)有的分離策略。
圖1：從癌癥患者血流中通過(guò)不同富集方法富集后CTC是一種實(shí)時(shí)液體切片。（a）物理特性包括大小、可變形性、密度和電荷。（b）物理特性基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，包括陽(yáng)性選擇上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）和陰性選擇CD45。所有這些技術(shù)已經(jīng)都被應(yīng)用于體外血液樣品，但是最近一種新型微檢測(cè)技術(shù)可以直接從患者臂靜脈中富集CTC，這表明其能在大約1500mL血液中富集CTC，可以采集更大量的CTC。疾病的階段不同，CTC有不同的衍生來(lái)源（例如原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移器官如肝、肺和骨髓），它們可以作為癌癥液體切片并能揭示重要的治療靶點(diǎn)信息和/或耐藥性機(jī)制，這些信息和機(jī)制可以用于將來(lái)接受如EGFR/HER2抑制劑或激素療法（如ER、AR）等靶向療法的患者分級(jí)并能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療效果和耐藥性的發(fā)展。縮略語(yǔ)：glyco A：血型糖蛋白A（存在于人體紅細(xì)胞胞外表面的131氨基酸蛋白）；RBC：紅細(xì)胞；ER：雌激素受體；PSA：前列腺特異性抗原；PSMA：前列腺特異性膜抗原；AR：雄激素受體；EGFR：上皮生長(zhǎng)因子受體。
最近，結(jié)合使用腫瘤相關(guān)物理和生物特性的試驗(yàn)已經(jīng)問(wèn)世，例如Ozkumur等人使用了一種結(jié)合基于CTC大小的流體動(dòng)力學(xué)細(xì)胞分揀技術(shù)和免疫磁性選擇技術(shù)（陽(yáng)性或陰性）的新型技術(shù)并將其稱之為新型“CTC-iChip”設(shè)備。
由于這些設(shè)備尺寸非常小，微型設(shè)備需要較小的樣品量和細(xì)胞量，從而可以使處理時(shí)間最短化并使昂貴染色試劑的使用最小化。但是分析如此少量的血液會(huì)對(duì)罕見(jiàn)CTC的檢測(cè)產(chǎn)生巨大的限制，尤其是大部分處于早期的癌癥?？朔@種限制的簡(jiǎn)單方法是在體內(nèi)直接靶定CTC。通過(guò)使用Gilupi nanodetector?已經(jīng)讓該方法成為現(xiàn)實(shí)。通過(guò)在外周臂靜脈上應(yīng)用這種設(shè)備30分鐘可以分析多達(dá)1.5升血液，包括CTC在內(nèi)，通過(guò)2cm納米檢測(cè)器的功能性區(qū)域并能讓大量CTC與抗EpCAM抗體結(jié)合。另一種方法是開(kāi)發(fā)白細(xì)胞去除術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞淘析以供使用流式細(xì)胞術(shù)執(zhí)行后續(xù)體外CTC分析和實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行CTC分子特性分析。
最近一項(xiàng)研究對(duì)CTC試驗(yàn)的特殊優(yōu)勢(shì)、技術(shù)挑戰(zhàn)和常見(jiàn)缺點(diǎn)（包括微流體技術(shù)）進(jìn)行了概述，報(bào)告也已經(jīng)發(fā)表。其中比較特殊的是Parkinson等人提供了現(xiàn)有CTC試驗(yàn)的綜合列表，跨國(guó)專家組對(duì)涉及的試驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)述。簡(jiǎn)而言之，微流體設(shè)備由于可以對(duì)流體高度可控并支持設(shè)備選擇，因此具有非常大的優(yōu)勢(shì)。但是這些設(shè)備有干擾血流的傾向如可能在血液內(nèi)產(chǎn)生氣泡或引起血凝塊。目前很難確定哪種物理原理在臨床捕獲CTC時(shí)更加具有優(yōu)勢(shì)。許多CTC技術(shù)基于腫瘤細(xì)胞比CTC更大更硬的假設(shè)，但是癌癥患者原始血液樣品CTC的大小變化顯著，經(jīng)受EMT的腫瘤細(xì)胞有和白血球一樣的彈性。電介質(zhì)和聲光特性以及腫瘤細(xì)胞膜邊緣波動(dòng)最近被引入，但是這些技術(shù)仍在接受臨床確認(rèn)。
作為一種備選方案，基于腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原表達(dá)（例如EpCAM、EGFR、HER2、MUC1）的CTC捕獲方案已經(jīng)存在，但是這種方法也存在腫瘤異質(zhì)性的問(wèn)題，除非使用靶定廣譜抗原的多種抗體才能解決這一問(wèn)題，但是使用這種方法可能影響富集CTC片段的純度。通過(guò)去除白細(xì)胞來(lái)陰性選擇CTC可以作為CTC無(wú)偏富集的備選方案，但是需要非常小心地執(zhí)行去除程序以避免CTC淹沒(méi)在正常血細(xì)胞的“海洋”中。最近，一種將通過(guò)大小選擇有序組合進(jìn)行CTC富集與基于抗體的捕獲或陰性去除CTC結(jié)合的方法出現(xiàn)，稱之為“CTC-iChip”。
將不同細(xì)胞系的細(xì)胞添加到正常血液內(nèi)的試驗(yàn)是評(píng)估新型CTC試驗(yàn)的良好開(kāi)端。但是這些細(xì)胞被選擇用于產(chǎn)生最佳的結(jié)果，從癌癥患者身上取得的原始血液樣品產(chǎn)生的結(jié)果通常較低。癌癥患者體內(nèi)的CTC更加多種多樣，穩(wěn)健性也低于多年的細(xì)胞系細(xì)胞傳代。因此，應(yīng)該對(duì)癌癥患者原始血樣進(jìn)行充分的分析，對(duì)新型試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。
上述大多數(shù)CTC試驗(yàn)使用相同的鑒別步驟：對(duì)細(xì)胞角蛋白（上皮腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)志物）進(jìn)行熒光染色，對(duì)白細(xì)胞共同抗原CD45（排除標(biāo)志物）使用細(xì)胞核染料（4,6-二氨基-2苯基吲哚（DAPI））染色。盡管一些用于捕獲CTC的抗原適用于多種癌癥類型（例如EpCAM適用于乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和其他上皮腫瘤），但是還是需要適用癌癥特異性檢測(cè)原則（例如前列腺癌PSMA或PSA）。因此相信一種試驗(yàn)適用于全部癌癥類型是非常幼稚的想法。
為了僅檢測(cè)活的CTC，就需要功能性上皮免疫斑點(diǎn)（EPISPOT）試驗(yàn)，該試驗(yàn)可以結(jié)合任意種類的富集步驟用于CTC分析。由于避免了和靶細(xì)胞的直接接觸，該技術(shù)基于24-48小時(shí)短期培養(yǎng)蛋白質(zhì)分泌、脫落和釋放評(píng)估CTC是否存在。EPISPOT已經(jīng)應(yīng)用于乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的血液和骨髓（BM）樣品，提供第一手臨床數(shù)據(jù)。
不僅如此，使用纖維光陣列掃描技術(shù)的超高速自動(dòng)數(shù)字纖維檢查已經(jīng)出現(xiàn)，用于檢測(cè)熒光抗體標(biāo)記的CTC。其他基于玻片自動(dòng)掃描顯微鏡也被用于CTC檢測(cè)，該技術(shù)具有前景但仍需要大量臨床研究確認(rèn)。
免疫檢測(cè)具有后續(xù)分離被染色CTC的優(yōu)勢(shì)，能進(jìn)行分子特性的分析。人工CTC分離已經(jīng)成為可能，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力。作為備選方案的自動(dòng)化單細(xì)胞選擇設(shè)備（例如基于介電泳技術(shù)的DEPArrayTM）因此被開(kāi)發(fā)出來(lái)。CTC的分子特性可能會(huì)增加試驗(yàn)的特異性，因?yàn)榉螩TC表型標(biāo)準(zhǔn)的上皮細(xì)胞已經(jīng)在良性結(jié)腸疾病患者中發(fā)現(xiàn)。
靶定特異mRNA的試驗(yàn)是用于替代免疫試驗(yàn)鑒別CTC的使用最廣泛的試驗(yàn)。乳腺癌患者中，CK19mRNA已經(jīng)成為臨床研究中使用最頻繁的mRNA。許多轉(zhuǎn)錄本（例如編碼CK18、CK19、CK20、粘蛋白1、前列腺特異性抗原和癌胚抗原）在正常血液和骨髓細(xì)胞中也有低水平表達(dá)，因此，需要用具有確認(rèn)截?cái)嘀档亩縍T-PCR試驗(yàn)來(lái)克服這一問(wèn)題。不僅如此，基因轉(zhuǎn)錄在CTC中可能被下調(diào)（例如在EMT條件下，見(jiàn)下文），這支持了多重標(biāo)志物RT-PCR方法。最近，Markou等人設(shè)計(jì)了一種新的液體微粒陣列雜交試驗(yàn)：對(duì)從免疫磁性富集CTC中分離的mRNA執(zhí)行多重PCR，以同步測(cè)量CTC中6種基因的表達(dá)。
原則上，腫瘤特異DNA畸變檢測(cè)是最具特異性的CTC檢測(cè)方法；但是實(shí)體瘤的顯著遺傳異質(zhì)性產(chǎn)生了一個(gè)問(wèn)題，這是因?yàn)橄嗤瑢?shí)體的不同腫瘤（例如乳腺癌）以及單一腫瘤中的不同細(xì)胞包含了不同遺傳畸變。因此需要針對(duì)不同遺傳畸變進(jìn)行大量研究，建立基于DNA的靈敏的檢測(cè)體系。不僅如此，原發(fā)腫瘤的遺傳分析不能預(yù)測(cè)CTC的DNA畸變，單一CTC的分離和直接遺傳分析在技術(shù)上仍具有很大挑戰(zhàn)。
細(xì)胞可塑性指的是一個(gè)有機(jī)體內(nèi)一些細(xì)胞呈現(xiàn)其他細(xì)胞特性的能力。上皮—間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）是導(dǎo)致細(xì)胞去分化的復(fù)雜過(guò)程，并通過(guò)重排細(xì)胞接觸連接增加運(yùn)動(dòng)性，最終使細(xì)胞喪失粘附性。與該過(guò)程相反的過(guò)程稱為間葉—上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（MET），該過(guò)程在CTC在遠(yuǎn)端器官固定后發(fā)揮基本作用并開(kāi)始形成新的微環(huán)境轉(zhuǎn)移。迄今為止，我們對(duì)控制上皮—間葉可塑性的觸發(fā)機(jī)制一無(wú)所知，即對(duì)轉(zhuǎn)移階梯反應(yīng)期間EMT和MET的平衡一無(wú)所知。
類間葉細(xì)胞出現(xiàn)在癌癥患者的血流中，這些細(xì)胞被當(dāng)前大多數(shù)基于上皮細(xì)胞標(biāo)志物如EpCAM和細(xì)胞角蛋白的試驗(yàn)遺漏。最近的研究顯示EMT尤其會(huì)影響具有類干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞。因此最近幾年，人們對(duì)研究CTC EMT標(biāo)志物興趣大增。最近的報(bào)告顯示現(xiàn)有基于上皮抗原的試驗(yàn)會(huì)遺漏最有侵略性的CTC亞群。因此，迫切需要完善CTC檢測(cè)方法，將EMT期間未被抑制的標(biāo)志物包含進(jìn)來(lái)但仍能夠通過(guò)分析來(lái)區(qū)分CTC與周圍血細(xì)胞（例如結(jié)腸直腸癌中的網(wǎng)素3）。最近Yu等人已經(jīng)用一組細(xì)胞表面抗原來(lái)捕獲乳腺癌轉(zhuǎn)移患者的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞CTC。但是，只能在低于50%的MBC患者中檢測(cè)到CTC，這比同一組用獨(dú)立EpCAM CTC試驗(yàn)公布的檢測(cè)率要低。這一結(jié)果的原因仍不清楚，但是卻表明開(kāi)發(fā)靈敏的間葉細(xì)胞CTC捕獲試驗(yàn)具有相當(dāng)?shù)碾y度。
最后，血小板在腫瘤播散中是否具有潛在作用？先前的研究表明血小板粘附誘導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞促存活和促血管生成信號(hào)。不僅如此，小鼠試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CTC結(jié)合血小板誘導(dǎo)EMT。已證明血小板存在于乳腺癌的CTC之上，被血小板覆蓋的CTC是否增強(qiáng)了其向附屬器官轉(zhuǎn)移的潛在能力并且在CTC富集步驟中是否可能被隱藏，可能引起人們研究的興趣。
CTC目前可以通過(guò)不同方法富集和檢測(cè)。但是未來(lái)我們需要開(kāi)發(fā)更佳的方法，分離和鑒別（i）具有下調(diào)上皮特異性蛋白表達(dá)的腫瘤細(xì)胞類EMT亞群以及（ii）具有器官特異性轉(zhuǎn)移特征的CTC子集以鑒別其起源。目前，為了富集CTC，基于去除CTC周圍白細(xì)胞的陰性選擇策略可能是無(wú)偏選擇腫瘤細(xì)胞包括那些缺乏上皮標(biāo)志物的播散細(xì)胞子集的可行性方法。
目前，CTC分析在臨床實(shí)踐中仍然不是常規(guī)腫瘤分期的一部分。這主要因?yàn)槭褂矛F(xiàn)有方法可檢測(cè)的CTC數(shù)量較低，限制了其作為“實(shí)時(shí)液體切片”的價(jià)值，對(duì)于早期腫瘤患者而言尤其是一種損失。因此，急需評(píng)估新創(chuàng)新方法的再現(xiàn)性、靈敏度和特異性，讓CTC檢測(cè)可以應(yīng)用于臨床實(shí)踐。關(guān)于CTC狀態(tài)的信息可以用于評(píng)估癌癥患者的個(gè)體預(yù)后并對(duì)危險(xiǎn)患者進(jìn)行分級(jí)以應(yīng)用系統(tǒng)療法來(lái)預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。此外，臨床實(shí)驗(yàn)的CTC測(cè)量可以作為重要的生物標(biāo)志物實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)個(gè)體癌癥患者的系統(tǒng)療法效果，并由此加速藥物的開(kāi)發(fā)，定義最高治療受益患者亞群。不僅如此，信號(hào)傳導(dǎo)途徑內(nèi)下游成分的CTC分析影響靶向療法（例如EGFR靶向療法K-ras突變或HER2靶向療法PI3K突變），能夠加深對(duì)復(fù)雜耐藥性機(jī)制的理解。
（摘自Royal Society of Chemistry，版權(quán)歸其所有，僅供內(nèi)部學(xué)習(xí)）
編譯：張凱
審校：王小茜
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