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科學(xué)合理得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是通過RNA－Seq成功回答生物學(xué)問題的先決條件。首先，我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理我們需要考慮的是選擇什么樣的文庫(kù)類型，測(cè)序深度，和重復(fù)的次數(shù)，其次選擇合適的測(cè)序平臺(tái)和測(cè)序方式，避免不必要的系統(tǒng)偏向性。

在細(xì)胞的total RNA中往往超過90%的rRNA都是核糖體RNA，而我們感興趣的mRNA只占1～2%。在真核生物中我們可以選擇用poly A選擇性富集mRNA或者去除rRNA的方式：poly A富集要求比較高的RNA起始量，且只允許RNA存在少量的降解，這種方式獲得reads通常落在已知外顯子的比例比較高；但是有一些生物學(xué)樣品（比如活檢組織）很可能不能提取得到足量的或者質(zhì)量較高的RNA，如果用poly A的方式富集可能會(huì)文庫(kù)質(zhì)量不佳，所以我們會(huì)推薦用去除rRNA的方式建庫(kù)。對(duì)于測(cè)序長(zhǎng)度的選擇，一般而言相對(duì)便宜的單端短測(cè)序reads足夠用來研究注釋比較完整的物種的基因表達(dá)情況，而雙短長(zhǎng)測(cè)序，適合用于從頭組裝，轉(zhuǎn)錄本鑒定，或者注釋不完備的物種研究。

對(duì)于測(cè)序的深度，主要依賴研究的目的，有些作者認(rèn)為最少5M的reads就足夠用于中等表達(dá)和高表達(dá)基因的定量，有一些則認(rèn)為需要測(cè)到100M的reads才能對(duì)稀有基因和低表達(dá)的基因精確定量。隨著測(cè)序深度的增加，可以鑒定到更多的基因，同時(shí)過高的測(cè)序量也可能導(dǎo)致背景噪聲的增強(qiáng)。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)候生物學(xué)重復(fù)的設(shè)置是很有必要的，它能增強(qiáng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)處理組之間發(fā)現(xiàn)顯著差異的基因的能力和可靠性。一般而言，每個(gè)組至少需要三個(gè)重復(fù)，重復(fù)的數(shù)量越多，驗(yàn)測(cè)顯著差異表的基因的準(zhǔn)確性和敏感度越高。同時(shí)，增加測(cè)序深度也可以提高檢測(cè)低豐度基因的能力。

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當(dāng)參考轉(zhuǎn)錄組或者參考基因組存在的時(shí)候，一般會(huì)同時(shí)或者選擇性比對(duì)到其中一個(gè)參考序列，對(duì)于人的樣品而言，一般而言根據(jù)比對(duì)軟件的不同，RNA－Seq數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組的比對(duì)率到70～90%之間，而當(dāng)reads比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的時(shí)候，因?yàn)橛行﹔eads來自之前尚未被注釋的新轉(zhuǎn)錄組，從而比對(duì)率會(huì)相對(duì)偏低一些；另外由于同一個(gè)基因的外顯子通過可變剪接會(huì)形成不同的轉(zhuǎn)錄本，從而這些來自不同轉(zhuǎn)錄本的reads因?yàn)楣蚕硗瑯拥耐怙@子，會(huì)有多處比對(duì)（multiple-mapping）的現(xiàn)象。通過數(shù)據(jù)比對(duì)，以及與已知轉(zhuǎn)錄本的比較，我們可以進(jìn)行基因表達(dá)定量分析，和轉(zhuǎn)錄本鑒定，新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)等分析。當(dāng)物種沒有參考基因組和轉(zhuǎn)錄組時(shí)，那么RNA－Seq分析的第一步應(yīng)該時(shí)把短reads組裝得到長(zhǎng)的contigs，把contigs當(dāng)成該物種的轉(zhuǎn)錄組，再把reads比對(duì)回去進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算。

利于短reads，如Illumina測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，是一件十分具有挑戰(zhàn)性的工作，短的reads很難跨過多個(gè)外顯子的連接位點(diǎn)，也難以覆蓋到轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始和終止位置，此外，組裝的算法比較復(fù)雜，效果也不是特別理想，在很多項(xiàng)目中，一些比較長(zhǎng)或者結(jié)構(gòu)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄本通過從頭組裝的方式，獲得的是幾十甚至上百個(gè)轉(zhuǎn)錄本碎片。而目前起步的第三代測(cè)序，如Pacific Biosciences的SMRT測(cè)序方式，能夠測(cè)序得到足夠長(zhǎng)的reads，從5’到3’端覆蓋整條完整的轉(zhuǎn)錄本，擁有比較好的發(fā)展前景。

基因表達(dá)定量是RNA－Seq中最常規(guī)應(yīng)用范圍最廣的分析。當(dāng)reads比對(duì)到參考基因組后，我們可以用cufflinks，HTSeq－count等軟件，根據(jù)基因在染色體上的位置進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算；當(dāng)reads比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組時(shí)，我們可以用RSEM，eXpress等工具進(jìn)行分析。對(duì)于表達(dá)量計(jì)算的關(guān)鍵在于統(tǒng)計(jì)有多少條reads是屬于特定某一條基因或者轉(zhuǎn)錄本的，之后考慮到基因或者轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度，測(cè)序的深度等等影響因素，會(huì)采用RPKM／FPKM，或者TPM的方式進(jìn)行均一化。在比較同一個(gè)基因在不同樣本里的表達(dá)量變化時(shí)，均一化基因長(zhǎng)度的步驟不是必須的，但是當(dāng)我們想要比較多個(gè)基因在同一個(gè)樣品中的表達(dá)量高低時(shí)，就需要考慮到長(zhǎng)度的影響，因?yàn)殚L(zhǎng)的基因經(jīng)過打斷后，會(huì)產(chǎn)生更多的reads。

當(dāng)進(jìn)行差異表達(dá)分析時(shí)，我們需要比較在不同樣品中基因的表達(dá)情況，由于任何一項(xiàng)技術(shù)都會(huì)存在或引入一些偏向性，差異表達(dá)分析軟件的作用，就是建立模型減少偏向性的影響，過濾背景噪聲，增加真實(shí)差異基因的檢出率（TPR），降低假陽性（FPR）。比如edgeR，DESeq2以及baySeq，EBSeq等常用軟件，假設(shè)基因的表達(dá)量分布是符合負(fù)二項(xiàng)分布的，用每個(gè)基因檢測(cè)到的reads數(shù)，以及覆蓋度，插入片段長(zhǎng)度，CG含量，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度等等可能存在偏向性的因素，輸入到統(tǒng)計(jì)模型中進(jìn)行計(jì)算，最終得到較為可靠的差異表達(dá)基因。對(duì)于樣品數(shù)及重復(fù)數(shù)非常少的研究，利用負(fù)二項(xiàng)分布來做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，可能背景噪聲比較高，我們會(huì)選用一些更加簡(jiǎn)單的模型，比如基于泊松分布的DEGseq，或者基于經(jīng)驗(yàn)分布（empirical distribution）的NOISeq。當(dāng)采用的差異表達(dá)軟件不同時(shí)，得到的結(jié)果，也會(huì)存在一定的差異，我們可以根據(jù)數(shù)據(jù)特征選取適合的軟件，或者綜合考量比較各個(gè)軟件的結(jié)果。

對(duì)于可變剪接分析，目前主流的方式主要分成兩大類：一類是基于轉(zhuǎn)錄本亞型（isoform）的表達(dá)定量，以及基因內(nèi)不同亞型組成的比例變化來做的，比如BASIS，CuffDiff2等軟件；另一種是根據(jù)比較reads在外顯子和junction區(qū)域的分析變化，來檢測(cè)單個(gè)可變剪接事件，比如DEXseq，DSGSeq，rMATS，DiffSplice等。

因?yàn)槎鷾y(cè)序讀長(zhǎng)有限，轉(zhuǎn)錄本亞型的定量仍存在較高的難度，目前而言定量的準(zhǔn)確性受讀長(zhǎng)的影響，準(zhǔn)確性不是很高；而對(duì)于單個(gè)可變剪接事件的鑒定，基于外顯子或者junction的方法精度要高很多，所以如果研究對(duì)象是特定某個(gè)外顯子的選擇性剪接，或者某個(gè)功能蛋白的結(jié)構(gòu)域，可以選擇基于外顯子或者juntion的方法。

RNA－Seq數(shù)據(jù)reads層面，或者覆蓋度層面的數(shù)據(jù)可視化，可以用ReadXplorer，UCSC browser，IGV等二代測(cè)序通用軟件來做，也可以用專門針對(duì)多個(gè)RNA－Seq數(shù)據(jù)可是化開發(fā)等RNAseqViewer來做，RNAseqViewer在基因結(jié)構(gòu)展示上，有一定優(yōu)勢(shì)，但速度比IGV慢。

因?yàn)槿诤匣蛲ǔＩ婕暗饺旧w重排，因此，在比對(duì)的時(shí)候就增加了額外的挑戰(zhàn)：比對(duì)軟件需要增加更大的搜索空間，比對(duì)的位置可能不是線性的，甚至可能不在同一個(gè)染色體上。當(dāng)我們找到潛在的嵌合序列后，需要經(jīng)過復(fù)雜的過濾步驟來降低假陽性，尤其需要注意排除相似度非常高的同源基因的影響，它們可能存在域染色體上的多個(gè)位置，從而不能唯一比對(duì)到基因組上；另外表達(dá)量非常高的序列，也不太可能是融合基因，畢竟融合基因是比較罕見的。測(cè)序長(zhǎng)度越長(zhǎng)，比對(duì)的準(zhǔn)確性越高，插入片段越大，也越有利于大的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)，所以我們推薦用較大插入片段的雙端測(cè)序數(shù)據(jù)來做融合基因的分析。

一般而言，RNA－Seq的功能注釋分析分為兩類：一類是比較差異表達(dá)基因和所有的基因的功能分類，推測(cè)是否某些功能的基因出現(xiàn)差異表達(dá)的比例更高；另一類是研究篩選的差異表達(dá)基因是否富集到某一些功能。

完整有效的數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行功能分析的前提條件，大部分的模式生物的注釋信息可以在Gene Ontology，Bioconductor，DAVID等數(shù)據(jù)庫(kù)找到，對(duì)于通過從頭組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列的物種，可以通過序列相似性比對(duì)到SwissProt或者Pfam，InterPro等數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋到其同源蛋白。Blast2GO可以用來做大規(guī)模的注釋，通常RNA－Seq得到的轉(zhuǎn)錄本序列50～80%可以得到注釋。

因?yàn)殚L(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）相對(duì)編碼的RNA更加不保守，所以數(shù)據(jù)要困難一些，Rfam中收錄了一些非編碼RNA家族，可以用來做分類，但lncRNA的功能注釋目前并沒有一個(gè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)做法。

RNA－Seq已經(jīng)成為了研究轉(zhuǎn)錄組的常用方法，其軟件與技術(shù)的更新升級(jí)發(fā)展迅速，但值得注意的是，不同軟件之間的一致性，受到參數(shù)和方法的影響，仍不是特別高，尤其是低豐度的基因定量是非常不穩(wěn)定的。

目前RNA－Seq的最熱門的兩個(gè)方向?yàn)椋簭姆浅Ｉ俚钠鹗剂繌墨@得轉(zhuǎn)錄組的信息，以及通過更長(zhǎng)的read得到更好的轉(zhuǎn)錄本注釋。單細(xì)胞RNA－Seq的發(fā)展十分迅猛，近幾年有不少高分文章產(chǎn)出，Smart－seq和Smart－seq2等技術(shù)通過適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增，讓研究單個(gè)細(xì)胞中微量的mRNA變得可能，從而實(shí)現(xiàn)組織中新細(xì)胞種類的鑒定，分類，以及研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的分子生物和生物化學(xué)過程。一般而言，做單細(xì)胞需要一定的數(shù)量才能做到亞群的精確分類，細(xì)胞數(shù)量太少，獲得的信息比較有限。長(zhǎng)reads測(cè)序平臺(tái)，比如Pacific-Biosciences SMRT和Oxford Nanopore，可以有效解決短reads RNA－Seq難以解決的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄本的組裝，以及高度相似轉(zhuǎn)錄本亞型的鑒定等問題，通過直接通讀整條轉(zhuǎn)錄本序列，而避免了組裝的過程，能夠獲得更加完整準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。當(dāng)然長(zhǎng)reads測(cè)序目前仍存在一些局限性，比如測(cè)序錯(cuò)誤相對(duì)較高，通量較低，從而不適合用于做表達(dá)定量。但這些可以通過與二代短reads測(cè)序相結(jié)合的辦法得到彌補(bǔ)。

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