Western的原理
幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強陰離子去污 劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結合并因此而帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多 肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結合1.4克去 污劑，借助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加 入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系 統(tǒng)具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘 氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的 氯離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠 前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復 合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。
電泳 丙烯酰胺凝膠電泳通常用來查看蛋白混合物樣品的復雜程度和監(jiān)測純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因為隨著膠厚度的增加，電泳時的熱效應會嚴重干擾蛋白的泳動。
Western bloting首 先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放 一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白 質通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結合。但是這種方法轉移效率低，通常只能轉移凝膠中的一小部分蛋白質（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進行轉 移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟?白質在電場力的作用下離開凝膠結合到NC膜上。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不 同。濕轉是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉移，用浸透緩沖液 的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，而其它的蛋白質不能與一抗結合，這樣清洗除去未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。目前有結合各種標記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當?shù)牡孜锶芤禾幚?，當酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿 性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉化為藍色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化 成褐色產(chǎn)物或將4-氯萘酚氧化成藍色產(chǎn)物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發(fā)光物質魯米諾 并發(fā)光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標蛋白質的存在了。除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也 使用其它探針如放射性標記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。
在Western bloting實驗中，有另一種方法，就是直接標記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標記二抗可用于很多種不同特 異性的一抗，避免了標記很多一抗的需要，同時因為一抗結合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強信號。所以一般情況下都釆用間接法進行檢測。
Western bloting要注意的一些問題
1、為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設計對照實驗，對照分為：陽性對照（最好有標準品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關對照（用無關抗體）
2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景
3、實驗設計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。
4、凝膠的質量直接影響以后的實驗結果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。
5、電泳、轉膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；
容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮——最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復打開使用多次的AP都別用
上樣電泳： 上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結果時，每個條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復使用電泳 Buffer（別小氣，重復使用會降低緩沖能力的）。當預染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達最佳分辨區(qū)——分離膠的2/3處，OK，電泳結 束了。
電泳結果檢查：如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結果呢？能先看看結果如何再進行下一步轉膜當然最好?？捡R斯亮藍使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟通用的蛋 白PAGE膠電泳染色方法?？墒怯捎诳捡R斯亮藍染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結合，會干擾后面的Western Blot實驗，很多人會選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉膜，一般也可以說明問題。所以最經(jīng)濟實惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉 移膜，檢測轉膜效果，充分脫色后不干擾Western結果。麗春紅的檢測靈敏度和考馬斯亮藍差不多。
轉膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質樣品需要經(jīng)過“轉膜”步驟——從PAGE膠轉移到膜上固定，才能用各種方法進行Western Blot的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴散，轉移要盡快進行轉膜的首要是選膜。
Western Blot印跡常用的轉移膜主要是硝酸纖維素膜（NitrocelluloseBlotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單 位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果 后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉移膜。
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