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免疫沉淀和免疫印跡（Western Blotting）

     在細胞生物學研究中，有時要對細胞膜分子、胞內分子或表達產物進行定性或／和定量。但由于靶蛋白表達水乎不太高，用細胞裂解液或表達上清進行SDS-PAGE電泳、免疫印跡（Western blot）檢測很難達到實驗目的。為此可用特異性識別靶蛋白的抗體進行免疫沉淀，純化和富集靶抗原。免疫沉淀所獲得的蛋白可進行SDS－PAGE電泳，經考馬氏亮藍染色或銀染后觀察目的蛋白條帶。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考馬氏亮藍染色或銀染的檢測下限，可采用 Western blot檢測方法，提高檢測的靈敏度，達到實驗目的。

免 疫 沉 淀

     （一）原理

免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復合物，沉淀經洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5－10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

     （二）試劑

    1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800 ml雙蒸水中，用HCl調PH至7.4，在補加水至1L，高壓滅菌后保存于室溫。

    2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml雙蒸水中，再補加水至100 ml，高壓滅菌。

    3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris堿，溶于80 ml雙蒸水，用 HCl調 pH至7.5，再補加水至100 ml。

    4．蛋白酶抑制劑：Aprotinin和Leupeptin溶于雙蒸水，PMSF溶于異丙醇，濃度均為10 mg/ml。

    5．N-40：10％（w／V）。

    6．脫氧膽酸鈉：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。

    7．細胞裂解液：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、l％NP-40、0.5％脫氧膽酸鈉。

    8．稀釋液：50 mM Tris（PH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg／ml PMSF、1 ug／ml Aprotinin，1 ug/ml  Leupeptin、0.1％NP-40。

    9．洗滌液 Ⅰ：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1％NP-40。

    10．洗滌液Ⅱ：10  mM  Tris（pH 7.5）。

    11．Protein  A／G－Agarose。

12．2×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液：100 mM  Tris（pH 6.8）、200 mM DTT、4％SDS、0.2％溴酚藍、20％甘油。

    （三）操作步驟

    1．離心收集細胞，PBS洗滌2次。細胞用量根據(jù)目的蛋白表達的水平而定，一般用 1×107－5×107 細胞。

    2．按 1×107 細/ml加人細胞裂解液，于冰浴上超聲破碎，然后再冰浴 30 min。

    3．4℃ 12 000 ×g離心 10 mn，取上清。

    4．往上清中加人50 ul的蛋白 A／G－agarose，于4℃在搖床上溫和搖1－3 h進行預清除。

    5．12 000轉離心20 s，取上清。

    6．將上清等分成兩份，補加稀釋液至1ml，其中一份加人1－10 ug識別目的蛋白的抗體，另一份加人等量的對照抗體，于4℃在搖床上溫和搖2 h，然后加入50 ul的蛋白A／G－Agarose于4℃在搖床上溫和搖過夜。

    7．離心棄上清，用洗滌液Ⅰ洗沉淀4次，洗滌液Ⅱ洗 2次，每次洗滌于4℃在搖床上溫和搖20 min。

    8．離心棄上清，用4號針頭盡可能移去液體。

9．加人20－50 ul的電泳上樣緩沖液，于100℃煮5－10 min，離心收集上清。上清中含有目的蛋白和抗體，可進一步用蛋白電泳和Western blot進行定性和定量。

    （四）注意事項

    1．不同種屬來源及不同亞類的抗體與蛋白A和蛋白G的－結合力不同（表），有的甚至不能結合，如小鼠的 IgM，這類抗體不能用蛋白 A／G－agarose直接免疫沉淀。

    2．PMSF對身體有害，注意防護。

3．根據(jù)免疫沉淀的結果，洗滌液Ⅰ的鹽離子濃度可作一定的調整，如果沉淀的雜蛋白較多可適當增加鹽濃度，如果抗體與目的蛋白的結合力較弱則適當減低鹽濃度。

不同種屬和不同亞類抗體與Protein A、Protein G的結合力

w：Weak binding，S：Strong binding，w／s：Indifferent，

nb：No binding，—：Information not available

免疫印跡（Western blotting）

 (一)原理

 Western blot是一種在 PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進行的抗原抗體反應。蛋白電泳后，將蛋白轉移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標記的二抗孵育，再進行底物顯色。由于抗原抗體反應特異性好，親合力高，Western blot檢測的靈敏度較高，尤其是采用酶促增強化學發(fā)光的方法（ECL）后，檢測的下限可達到pg水平。ECL是指酶催化底物發(fā)熒光，熒光可使X光片曝光。由于酶標記在二抗上，二抗與一抗結合，而一抗特異性結合在目的蛋白條帶處，因此顯影、定影后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。

（二）試劑和材料

1. PVDF膜或NC膜。

2.電泳緩沖液：25 mM Tris堿、250 mM甘氨酸、0.1％SDS。

3.轉移緩沖液：實驗所用的PVDF或NC膜不同，轉移緩沖液也可能不同，因此請仔細參閱PVDF或NC膜說明書。

4.TBS（pH7.5）：6.05 g Tris堿（50mM）、8.76g NaCl（150mM）溶于800 ml雙蒸水,用 HCl調 PH至7.5，補加水至1L。

5.TBST：TBS＋0.1％（v／v）Tween 20。

6.封閉液：1％試劑盒中的封閉液，或5％脫脂奶粉，溶于TBS中。

7.解離液：100 mM 二巰基乙醇、2％SDS。

8.化學發(fā)光Western blot試劑盒：生產這類試劑盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等，試劑盒中一般包括酶標記二抗、發(fā)光波A和B。

（三）操作步驟

1. 灌制SDS－PAGE電泳膠，方法參見一般的分子生物學實驗方法。

2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上樣，電泳。

3. 用電轉移裝置將蛋白轉至PVDF或NC膜上。

4. 電轉移完畢后，取出膜,用TBS洗滌1次。

5. 將膜放入封閉液 于室溫封閉1 h, 或4℃封閉過夜。

6. 用封閉液稀釋識別目的蛋白的抗體至1－10 ug/ml，與含有目的蛋白條帶膜在室溫作用1 h。

7. TBST洗膜4次,每次15 min。

8. 按試劑盒說明書稀釋酶標記二抗,與膜于室溫作用30min。

9. TBST洗膜4次，每次15 min。

10. 按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用1 min后進行X光片曝光。

11. X光片顯影和定影后觀察結果。

12. 如果結果不理想或要用相同的膜檢測另一種靶蛋白，可將膜與解離液于50℃作用30 min，去除結合于膜上的抗體, TBST洗2次，封閉后可重新檢測（即重復 6－11步）。

 (四) 注意事項

1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗體最好不同，否則將出現(xiàn)很多非特異性條帶。

2. Western blot中，轉移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，其空間結構被改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western blot檢測。這種情況下，可將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用抗體進行免疫沉淀，得到的生物素化的目的蛋白可用酶標記親和素進行Western blot檢測。

3.化學發(fā)光法檢測的敏感度很高，實驗中取膠和膜必須帶一次性手套。

4. 曝光、顯影和定影需在暗室中進行，X光片用完后一定要收好，避免曝光。