安捷倫（Stratagene）
說到定點(diǎn)突變，我們?cè)趺茨芡薗uikChange呢？這個(gè)明星產(chǎn)品被數(shù)以千計(jì)的文獻(xiàn)所引用，成為許多突變實(shí)驗(yàn)的首選。如今，Stratagene公司已被安捷倫科技公司收購，但仍在不斷提供新的產(chǎn)品，比如這款俗稱閃電的QuikChange Lightning定點(diǎn)突變?cè)噭┖小?/font>
QuikChange系列試劑盒也利用DpnI來去除甲基化的親本質(zhì)粒，不過它的引物設(shè)計(jì)策略與Q5不同，是使用兩條直接互補(bǔ)的寡核苷酸，各自包含突變。這些引物退火和延伸后，產(chǎn)生了帶切口的質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后修復(fù)。由此可見，突變過程分為簡(jiǎn)單的三步。首先使用熱循環(huán)儀合成突變鏈，然后使用DpnI降解親本DNA模板，最后通過轉(zhuǎn)化步驟完成實(shí)驗(yàn)。
安捷倫認(rèn)為，這種線性擴(kuò)增策略只以親本DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，能減少不必要的錯(cuò)誤。由于循環(huán)次數(shù)少而模板的起始量較高，因此確保了以最少的錯(cuò)配進(jìn)行穩(wěn)定的線性擴(kuò)增。這種非PCR的方法結(jié)合保真度超高的聚合酶，幾乎可完全消除不需要的第二位點(diǎn)突變。
之前的QuikChange版本使用的是PfuUltra高保真DNA聚合酶，Lightning新版本則采用專利配方的QuikChange Lightning DNA聚合酶。這種融合型的聚合酶具有增強(qiáng)的持續(xù)合成能力，極為準(zhǔn)確和高效，能擴(kuò)增長(zhǎng)片段的目標(biāo)序列，且延伸速度更快（30秒/kb）。而新的DpnI酶將消化時(shí)間從1小時(shí)縮短到5分鐘。因此，QuikChange Lightning試劑盒可以在三小時(shí)內(nèi)引入點(diǎn)突變、插入突變或缺失突變，隨后進(jìn)行過夜轉(zhuǎn)化。
這個(gè)試劑盒中包含了QuikSolution試劑，可促進(jìn)大片段質(zhì)粒的復(fù)制。因此，它適合富含GC的復(fù)雜質(zhì)?；蜷L(zhǎng)達(dá)14 kb的大片段質(zhì)粒。此外，QuikChange系列還有多點(diǎn)突變?cè)噭┖?，可同時(shí)在五個(gè)不同位置上對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變；而QuikChange HT能產(chǎn)生最多含12萬個(gè)重組突變體的大型突變庫，適合蛋白質(zhì)工程研究。
賽默飛世爾
Phusion高保真聚合酶大家也許用過，至少聽說過。以這款酶為核心，賽默飛世爾也推出了Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit，可在任何類型的質(zhì)粒DNA中引入點(diǎn)突變、插入或缺失。它的突變策略與Q5相似，都是采用背對(duì)背的引物，擴(kuò)增突變的DNA。這種方法的好處是能夠在引物的5’端加上一條尾巴，而插入較長(zhǎng)的片段（100 bp左右）。Phusion Hot Start II DNA聚合酶在突變過程中發(fā)揮重要作用，以其高保真性而減少了不想要的二次突變，適用于10 kb以下的質(zhì)粒。
整個(gè)操作流程與Q5相似，不過少了一個(gè)降解起始模板的步驟。該公司認(rèn)為，在這種方法中，痕量的模板DNA被指數(shù)擴(kuò)增，因此未突變模板所占的比例是極小的，也就沒有必要在單獨(dú)的步驟中破壞它。不過，需要注意的是，這個(gè)試劑盒需要磷酸化的引物，因?yàn)樵噭┖兄泻蠺4 DNA連接酶，而非激酶。
Clontech
Clontech的In-Fusion克隆系統(tǒng)聽上去像是個(gè)做克隆的，其實(shí)它也能用于定點(diǎn)突變。它結(jié)合In-Fusion HD酶以及反向PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了各種突變。突變中所采用的兩條引物有著相反的方向，但5’端有著15 bp的重疊，并摻入了感興趣的突變。
在實(shí)驗(yàn)過程中，首先是設(shè)計(jì)引物，然后利用高保真的CloneAmp HiFi DNA聚合酶開展PCR反應(yīng)，得到線性的PCR產(chǎn)物。之后再開展In-Fision反應(yīng)，利用重疊的15 bp讓線性DNA重新環(huán)化，接著就是轉(zhuǎn)化和篩選了。CloneAmp HiFi這種酶的性能也是杠杠的。根據(jù)Clontech的數(shù)據(jù)，它的延伸速度極快，每kb只需5秒。此外，錯(cuò)誤率也很低，復(fù)雜模板上大約每45200個(gè)堿基有一個(gè)錯(cuò)配。
環(huán)化過程就是著名的In-Fusion反應(yīng)。憑借In-Fusion酶獨(dú)特的末端接合能力和15 bp重疊，線性DNA就能輕松環(huán)化。當(dāng)然，這種克隆體系也兼容任何載體。對(duì)于普通克隆，只要載體和插入片段的末端有15個(gè)相同的堿基，克隆就能輕松完成，就是這么任性。
應(yīng)用
研究人員可以利用定點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)多個(gè)體外應(yīng)用，不過最廣泛的應(yīng)用還是改變表達(dá)載體上的氨基酸。另外一個(gè)應(yīng)用是插入比較短的序列（最多100 bp），比如蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或者在當(dāng)下熱門的CRISPR應(yīng)用中，插入向?qū)NA序列。這可以通過Q5或Phusion定點(diǎn)突變?cè)噭┖衼韺?shí)現(xiàn)。
當(dāng)然，DNA合成正變得越來越便宜，研究人員也可以選擇合成突變基因，而不是改變現(xiàn)有的序列。不過，對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室而言，基因合成仍然是比較貴的。隨著價(jià)格的下降，這種局面可能會(huì)改變，不過就目前而言，定點(diǎn)突變?cè)噭┖腥允莻€(gè)好選擇。（生物通 余亮）
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