該篇文章綜述通過結合將近250篇已有文獻報道，討論了ctDNA在腫瘤早期預測，分子圖譜和動態(tài)監(jiān)測等等方面中的應用情況。
文章題目：Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA
研究團隊：Cancer Research UK，Clinical Trials Unit and so on.
發(fā)表時間：24 February 2017
期刊名稱：Nature Reviews Cancer
影響因子：37.147
研究背景
自從1948年 Mandel and Métais 在血液中首次發(fā)現了cfDNA后，人類便開始了對血液游離DNA的探索。最初發(fā)現正常人每毫升血漿里面大概有1 ~10 ng的cfDNA。而后在1977年腫瘤病人體內發(fā)現了更高濃度的cfDNA。后來又在不同的生理狀況和臨床時期也發(fā)現了高濃度的cfDNA存在，例如劇烈運動和炎癥等條件下血液中的cfDNA含量都會發(fā)生變化。1969年 Thomas Ashworth發(fā)現CTCs存在。后來在孕婦的血漿中發(fā)現胎兒的DNA序列，繼而衍生出一系列的產前診斷的臨床應用(NIPT等等)。1994年KRAS突變序列第一次在胰腺癌患者的血液cfDNA中發(fā)現，隨之開啟了ctDNA的研究時代。2012年高深度多基因panel測序的開始，使得在一次試驗中檢測多種腫瘤相關基因成為可能。
目前液體活檢主要的應用領域是腫瘤的血液檢測，即利用血液中檢測到ctDNA來揭示腫瘤的進展和對藥物的反應，進一步精準指導個性化用藥治療等等。隨著實驗和信息分析技術的進步，液體活檢臨床應用的技術優(yōu)勢越來越明顯。雖然關于ctDNA的生物學研究目前還不是十分明確，但是當前是一個十分令人興奮的時期，因為ctDNA正在開始應用于臨床，并使人獲益。
ctDNA的腫瘤應用研究概況
ctDNA的臨床應用研究進展大致如Figure1a：ctDNA在腫瘤病人的各個時期進行監(jiān)管治療。臨床應用大致基于Figure1b的兩大部分ctDNA分析信息(在預后的檢測分析中，還可以評估耐藥性的出現和定量殘留疾病)。
Figure1. ctDNA的臨床應用研究與分析
從生物學上來認識cfDNA和ctDNA等循環(huán)遺傳物質
人體的血液中包含從各個組織中釋放出來的cell-free DNA (cfDNA) and RNA (cfRNA); proteins; cells; and vesicles (such as exosomes)。cfDNA除了來自細胞凋亡，壞死和分泌到血液中的DNA，還存在于其他一些體液中，像尿，腦脊髓液，胸腔積液，唾液等等。對cfDNA在基因組和表觀修飾方面的研究，可以追溯其來源。例如甲基化的分析，就揭示了大部分的cfDNA來源于正常人的造血細胞。研究表明cfDNA的半衰期在16 minutes and 2.5 hours，這樣cfDNA的研究就像一臺實時照相檢測手段。cfDNA的峰值長度在166bp左右（大約147bp的纏繞核小體的DNA長度+鏈接H1組蛋白的DNA長度=166bp），在血液里，ctDNA的長度小于沒有發(fā)生突變的cfDNA的分子長度，為什么長度會偏短的機制現在還不是很清楚。cfDNA在免疫和細胞傳遞等方面都發(fā)揮著重要的作用。
1983年Pan and Johnstone 首次發(fā)現并描述了外泌體，外泌體由多種類型細胞釋放到細胞間隙和體液中，長度大約在40-100nm。外泌體可以通過密度梯度離心，超高速離心和表面標志物等方法提取獲得。外泌體在細胞之間的信息交換中起著關鍵的左右。在外泌體中含有蛋白質和一些列的核酸（DNA, mRNAs, and miRNAs），研究表明他們可以調節(jié)受體細胞的活性。更有研究顯示exosomal miRNAs能夠刺激血管形成和遠端轉移。它的優(yōu)勢在于循環(huán)的遺傳物質量比較大，適合ctDNA含量少的疾病研究。
ctDNA的分析策略
ctDNA的分析策略包括單點或多重PCR，目標區(qū)域捕獲測序和WGS。三種分析策略的特點與比較詳見table1：
table1：ctDNA分析策略的特點與比較
注： 1】特異性等位基因PCR使得hotspot突變的分析變得十分靈敏。
2】targeted sequencing：可在等位基因頻率小于0.1%時檢測出ctDNA。
3】sWGS（shallow WGS）只能檢測到等位基因突變的5%-10%的片段，所以不適合應用于疾病的早期研究上。更適合于嬰兒的染色體異常篩查和腫瘤相關的拷貝數變異檢測。
4】由于血清中含有大量的免疫細胞污染，因此使用血漿作為樣本效果更佳。
具體的分析研究與應用
1、腫瘤不同時期ctDNA的檢測
研究表明血漿中ctDNA 的含量和腫瘤的大小、分期有一定相關性。當然這種相關性也不是絕對的。一項關于640個不同類型和時期的腫瘤患者的研究表明，IV期的ctDNA濃度中位數是I期的100倍。定量研究顯示I期患者每5ml血漿中的ctDNA突變拷貝數小于10個，但在部分晚期患者中卻是100-1000個拷貝數左右。最近一項研究，ctDNA的水平與復發(fā)性高級別的漿液性卵巢癌腫瘤體積大小密切相關。腫瘤體積每增加1 cm3，ctDNA等位基因的突變頻率會增加0.08%。此外還有很多研究表明，預后可以檢測到ctDNA的患者比沒有檢測到的患者預后差。除了定量研究，對ctDNA突變頻譜的研究可將患者按照不同的分子亞型進行分類，進行精準預后。
2、ctDNA 在疾病的早診中的應用
疾病的早期診斷（尤其是在轉移前）有助于進行疾病的早期干預并提高預后生存質量。疾病的突變在唾液和血液中可先于臨床診斷2年被檢測出來。
但是腫瘤的早篩仍存在很多問題。一項基于多種類型腫瘤進行ctDNA檢測的研究表明，在IV期的患者中有82%的ctDNA檢出，但在I期患者中只有47%檢出。droplet dPCR (ddPCR) 應用于乳腺癌早期突變篩查靈敏度可達到93.3%，但在針對非小細胞肺癌I期患者的ctDNA檢測中，突變在患者血漿中的檢出率為50%?？梢姴煌愋偷哪[瘤早診的檢出率是有差異的。還有研究顯示病毒相關的腫瘤，檢測病毒在cfDNA中的情況可能會比ctDNA更能提早預知疾病。
隨著實驗和分析技術的發(fā)展提高，生物學和基因組的因素開始變?yōu)閏tDNA 研究上最大的限制條件。在正常人中發(fā)現腫瘤相關基因突變等現象，都需要后續(xù)研究他們的生物學和臨床上的意義。
3、腫瘤的發(fā)病定位
在腫瘤篩查早期，甲基化和核小體的占用模式信息可以幫助定位腫瘤原發(fā)灶的位置（何種組織和何種細胞）。一項研究成功運用該技術發(fā)現患者患有濾泡性淋巴瘤。
4、Noninvasive molecular profiling
4.1 克服腫瘤的異質性
腫瘤的異質性在近年來已經得到了共識。同一患者不同部位，轉移和原發(fā)組織也都存在異質性。取很多組織活檢樣品進行研究幾乎是不可能的，而少量點取樣的結果又不能正確反映基因突變情況，指導后續(xù)的個性化用藥就會存在偏差。ctDNA的優(yōu)點在于能夠避免腫瘤內部異質性和不同部位的腫瘤之間的異質性。
4.2 熱點突變和gene panel
ctDNA檢測突變和組織中檢測突變的一致性大概在65%-98%。
4.3 結構變異
一項關于80個前列腺癌病人的研究表明，雄激素受體的拷貝數增加的樣品藥物治療之后預后比較差。
注：1】Copy number alterations can be detected in cfDNA using WGS, amplicon-based and hybrid-capture approaches.
2】Chromosomal rearrangements in plasma can be identified through both WGS and hybrid-capture sequencing approaches。
5、縱向長期監(jiān)測
治療效果和ctDNA的動態(tài)變化聯系緊密且迅速，這種動態(tài)變化的ctDNA檢出時間一般會比臨床確診要早很多。如在乳腺癌患者治療過程中，ctDNA濃度隨化療過程而變化，這種反映療效的變化趨勢比其它其它檢測手段要早，ctDNA對乳腺癌復發(fā)的提示時間也要比影像學、血液檢查（如CA15-3）等技術早。同樣的研究結果在復發(fā)性卵巢癌中也存在。
7、微小殘留和復發(fā)監(jiān)控
在治療和術后發(fā)現ctDNA，這樣的腫瘤患者可能有著更高的復發(fā)風險和更低的生存率。對高風險的患者采取相應的輔助治療，從而使其獲益。這也使得腫瘤復發(fā)和轉移的早期監(jiān)控成為可能。
在腫瘤監(jiān)測的時候，病人特有的一些結構變異更適合作為監(jiān)測對象，因為結構變異相對于點突變而言更精確靈敏，受噪音影響比較小。日后根據病人的實際突變情況設計個人panel進行應用研究有望成為可能。
8、克隆進化和耐藥研究
ctDNA能夠檢測腫瘤的克隆進化和發(fā)現對治療耐藥機制的產生。多階段多點的液體活檢可用于腫瘤的治療過程對藥效的監(jiān)控，一旦耐藥突變產生，有助于及時調整治療方式，實施精準用藥。
Figure2. ctDNA動態(tài)監(jiān)測調整治療方式
目前問題和未來的方向
隨著ctDNA和cfDNA的起源和生物學意義逐漸深入了解，ctDNA在藥物發(fā)展，腫瘤內部異質性和克隆進化等方面都將發(fā)揮著更大的作用。但是現階段我們對cfDNA的釋放等機制還不是很清楚，很多現有的問題現象還得不到很好的解釋。在克隆進化方面，不清楚是所有的亞克隆都釋放到血液里面還是會受到一些腫瘤血管和代謝的影響。對于罕見突變的檢測靈敏性不高，還需實驗和信息分析技術的進一步提升。關于循環(huán)核酸，蛋白和多種體液的研究（多組學的研究關聯分析，如 mRNA and microRNA）能夠增強檢測的精準性和敏感性，勢必是未來的研究發(fā)展方向。
參考文獻：
[1] Jonathan C. M. Wan,Charles Massie,Javier Garcia-Corbacho, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA[J].Nature Reviews Cancer, 2017,17:227-238.
