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美國達(dá)納-法伯癌癥研究所的研究團(tuán)隊(duì)將一種針對多個(gè)個(gè)性化腫瘤新抗原的癌癥疫苗應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)該疫苗安全性良好，且能在患者體內(nèi)引起針對新抗原的免疫應(yīng)答，以靶向性的方式對抗腫瘤。該論文與我們上期解讀的論文（個(gè)性化RNA疫苗：喚醒人體內(nèi)的抗癌武器）同期在Nature發(fā)表。

腫瘤新抗原是一類由腫瘤特異性突變所產(chǎn)生的，且能與HLA結(jié)合的短肽段。有效的抗腫瘤免疫與作用于腫瘤新抗原的T細(xì)胞的存在密切相關(guān)，這些T細(xì)胞不存在于正常組織內(nèi)，避免了中樞胸腺耐受，因此是高度免疫性的。雖然腫瘤新抗原一直被認(rèn)為是抗腫瘤免疫響應(yīng)的最佳靶標(biāo)，但只在最近大規(guī)模并行測序檢測腫瘤組織中所有編碼區(qū)突變，及機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測與自體HLA高親和力結(jié)合的突變肽段等技術(shù)的發(fā)展下，該方法才變得可行。

1.研究對象：

    10名黑色素瘤病人用于全外顯子測序和RNA-seq測序

    6名患者注射疫苗，其中4名IIIB/C期，2名IVM1a/b期（肺轉(zhuǎn)移）

2.測序方法：

    全外顯子測序

    RNA-seq測序

    RNA-seq單細(xì)胞測序

3.試驗(yàn)方法：

    干擾素-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）

    細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色

    流式細(xì)胞術(shù)

4.研究方法：

    NetMHCpan軟件

為了生成個(gè)性化新抗原的疫苗，研究人員用全外顯子測序技術(shù)對成對的腫瘤和正常細(xì)胞進(jìn)行測序分析，鑒定體細(xì)胞突變。用RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)對腫瘤中突變基因進(jìn)行篩選，然后用NetMHCpan軟件預(yù)測哪些突變多肽是最有可能結(jié)合自身的HLA-A或者HLA-B蛋白。利用預(yù)測結(jié)果生成臨床等級的長肽，每個(gè)病人產(chǎn)生20個(gè)新抗原，與Toll樣受體3(TLR3)和黑色素瘤變異相關(guān)蛋白5(MDA-5)激動(dòng)劑poly-ICLC混合。在先前未經(jīng)過治療的高危黑色素瘤病人(IIIB/C期和 IVM1a/b期)經(jīng)過手術(shù)切除后的臨床一期研究中評估疫苗的效應(yīng)。

1.疫苗的制備與接種

研究者通過對10名患者的腫瘤組織以及對照組織進(jìn)行全外顯子測序，得到體細(xì)胞突變，同時(shí)通過RNASEQ測序方法驗(yàn)證體細(xì)胞突變的表達(dá)情況。然后用NetMHCpan軟件預(yù)測突變序列中能結(jié)合到MHC I類分子的表位，在篩選的過程中優(yōu)先篩選致癌基因突變的，然后按照突變肽段與MHC I類分子結(jié)合的親和力大小進(jìn)行篩選。在10個(gè)檢測的病人中，有8個(gè)病人在黑色素瘤中具有較高的突變率，攜帶了一些與黑色素瘤相關(guān)的基因，其主要突變類型為C-T轉(zhuǎn)換（與紫外線暴露的結(jié)果相一致），表達(dá)多個(gè)黑色素瘤相關(guān)的marker。對于這8名患者合成13-20條長度為15-30個(gè)氨基酸的免疫長肽段（IMP），并分為4種免疫池。其中6位病人開始接種疫苗，每個(gè)病人完成了5次初種、2次加強(qiáng)的全過程。治療相關(guān)的不良事件包括輕度流感樣癥狀，注射部位反應(yīng)， 皮疹以及疲勞等。

2.臨床I期結(jié)果

在接種疫苗后進(jìn)行了平均25個(gè)月的隨訪，4個(gè)IIIB/C期病人沒有復(fù)發(fā)現(xiàn)象，2個(gè)IIIB/C期病人（肺轉(zhuǎn)移）在最后一次接種后均有復(fù)發(fā)現(xiàn)象，隨后，對復(fù)發(fā)的兩個(gè)病人用抗PD1抗體藥物派姆單抗（pembrolizumab）進(jìn)行治療，經(jīng)過4個(gè)療程后均獲得了完全的影像學(xué)響應(yīng)（注：派姆單抗在轉(zhuǎn)移黑色素瘤中作為一線治療的影像學(xué)響應(yīng)率為6.1%）

圖1：高危黑色素瘤病人生成個(gè)性化疫苗以及注射后的臨床反應(yīng)

3.疫苗接種后誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答

合成試驗(yàn)肽（ASP）和表位肽（EPT）用于分析免疫監(jiān)測的抗原形式。試驗(yàn)肽覆蓋了整個(gè)免疫肽肽段，由15-16個(gè)氨基酸組成，每個(gè)肽段之間至少重疊11個(gè)氨基酸，表位肽由9-10個(gè)氨基酸組成，將試驗(yàn)肽和表位肽進(jìn)一步合并并匹配到對應(yīng)的IMP肽池。通過離體干擾素-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT），在多個(gè)ASP肽池(3/4)中觀察到外周血單核細(xì)胞(PBMC)反應(yīng)，說明6個(gè)病人均對多個(gè)預(yù)測表位產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)。通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法（ICS），發(fā)現(xiàn)大多數(shù)PBMC對肽池的離體IFN-γ-陽性反應(yīng)都是由CD4+ T細(xì)胞引起的。

雖然新抗原的CD8+T細(xì)胞的響應(yīng)不能直接通過離體IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法或胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法直接檢測到，但是通過對PBMC進(jìn)行體外預(yù)刺激之后，在6個(gè)病人的8個(gè)EPT肽池中（一個(gè)患者至少一個(gè)肽池）中檢測到IFN-γ分泌物。在接種前收集的預(yù)刺激樣本中，對這些EPT肽池不存在響應(yīng)，說明是在接種后產(chǎn)生了新的CD8+ T細(xì)胞響應(yīng)。對所有的病人來說，新抗原反應(yīng)產(chǎn)生的30%的CD4+和 CD8+T細(xì)胞都是多功能的，一般都有2-3種炎癥性細(xì)胞因子的分泌物。

圖2：高危黑素瘤患者在接種疫苗后誘導(dǎo)了強(qiáng)大的多功能CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答

為了驗(yàn)證是哪些預(yù)測的表位刺激T細(xì)胞反應(yīng)，研究人員運(yùn)用去卷積法對離體和預(yù)刺激ELISPOT實(shí)驗(yàn)的肽池進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞對其中15個(gè)免疫肽產(chǎn)生的表位肽存在響應(yīng)，CD4+T細(xì)胞對離體試驗(yàn)中19個(gè)免疫肽對應(yīng)的試驗(yàn)肽存在響應(yīng)，在預(yù)刺激試驗(yàn)中，CD4+T細(xì)胞對39個(gè)免疫肽存在響應(yīng)。通過對突變型肽段和對應(yīng)的野生型肽段進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞會(huì)優(yōu)先對突變的肽段進(jìn)行反應(yīng)。對于一些預(yù)測表位，T細(xì)胞群體在很低的濃度下依然存在反應(yīng)，這或許可以用于識(shí)別肽段-MHC復(fù)合物較少的腫瘤細(xì)胞，上述這些數(shù)據(jù)表明了腫瘤新抗原相較于對應(yīng)的野生型抗原具有較高的特異性。

圖3：疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞可以區(qū)分野生型和突變型的抗原；檢測內(nèi)源性加工和呈遞的肽段

研究人員用了多種方法證明實(shí)驗(yàn)中檢測到的T細(xì)胞反應(yīng)是指向內(nèi)源性處理和呈遞的新抗原，發(fā)現(xiàn)新抗原反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞系的自體抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)包含突變位點(diǎn)的25肽的串聯(lián)微基因，對野生型和突變型編碼微基因有不同反應(yīng)的CD8+T細(xì)胞系，不能識(shí)別突變型和野生型的肽段，說明內(nèi)源性加工在野生型和突變型的肽段中是不同的。

為了分析疫苗誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的頻率與表型，研究人員生成了HLA II型四聚體用來檢測對新抗原反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞，在第16周檢測到RUSC2（患者1）和ARHGAP29（患者4）反應(yīng)的T細(xì)胞，占所有循環(huán)CD4 + T細(xì)胞的約0.03-0.06％，其中ARHGAP29反應(yīng)細(xì)胞在24周時(shí)持續(xù)存在。為了表征這些細(xì)胞的功能狀態(tài)，研究者通過RNA-seq單細(xì)胞測序法對接種前的CD4+T細(xì)胞和接種后四聚體陽性的CD4+T細(xì)胞的表達(dá)量進(jìn)行分析，聚類情況顯示接種前和接種后的T細(xì)胞存在強(qiáng)烈的分離情況，數(shù)百個(gè)基因在接種后表達(dá)量發(fā)生了改變?；虮磉_(dá)的主要變化反映了從初始T細(xì)胞到效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

患者2和患者6在經(jīng)過派姆單抗治療后均獲得了完全的影像學(xué)響應(yīng)，研究者收集了經(jīng)過抗PD-1治療9-12個(gè)月的樣本通過IFN-γ ELISPOT試驗(yàn)檢測對于ASP和EPT的響應(yīng)。對于病人2和病人6來說，CD4+T細(xì)胞分別對25個(gè)(4個(gè)新的)和15個(gè)(2個(gè)新的)ASP存在響應(yīng)，CD8+分別對2個(gè)和4個(gè)EPT存在響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過檢查點(diǎn)阻斷治療后，隨著時(shí)間的變化，疫苗誘導(dǎo)的新抗原反應(yīng)持續(xù)存在，新抗原特異性T細(xì)胞也有所增多。

圖4：疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞在其轉(zhuǎn)錄過程中的廣泛轉(zhuǎn)變；新抗原特異性T細(xì)胞在PD-1阻斷后仍然存在并有所增加

研究人員通過一系列臨床研究以及免疫應(yīng)答檢測，證明了個(gè)人腫瘤新抗原疫苗是安全可行的，并且能夠在臨床環(huán)境中引起強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，且不受以前或者正在進(jìn)行的治療的影響。使用新抗原疫苗有助于解決腫瘤免疫領(lǐng)域兩個(gè)主要的挑戰(zhàn)：靶向高度異質(zhì)的腫瘤，以及準(zhǔn)確靶向腫瘤而非健康組織。未來的新抗原疫苗將利用改進(jìn)的預(yù)測抗原呈遞的方法來增加新抗原誘導(dǎo)的反應(yīng)T細(xì)胞，以及研究與檢查點(diǎn)阻斷和其他免疫治療劑之間的協(xié)同作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] , et al. [J]. Nature, 2017, 547: 217-221.