早期哺乳動物胚胎主要由三種不同組織發(fā)育而來:外胚層（epiblast）來源的胚胎組織，滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm）來源的胎盤以及原始內(nèi)胚層（primitive endoderm）來源的卵黃囊，胚胎組織與上述兩種胚外組織相互調(diào)節(jié)、共同協(xié)作是胚胎結(jié)構(gòu)完整功能完善的重要前提。胚胎植入后，臟側(cè)內(nèi)胚層（visceral endoderm, VE, 可發(fā)育為原始內(nèi)胚層）誘導(dǎo)外胚層極化并開始成腔，隨后與滋養(yǎng)外胚層來源的胚外外胚層的腔整合形成前羊膜腔，這些過程的正常進(jìn)行對后續(xù)的胚胎對稱發(fā)育狀態(tài)打破、前后軸形成及原腸胚形成的起始至關(guān)重要。
由于缺乏來自胚外組織的信號誘導(dǎo)，單獨(dú)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞（ESCs）時(shí)，其細(xì)胞數(shù)量及空間構(gòu)造都與正常胚胎有所區(qū)別，因此其模擬早期胚胎發(fā)育關(guān)鍵事件的作用很有限。英國劍橋大學(xué)的Magdalena Zernicka-Goetz教授團(tuán)隊(duì)將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）與胚外滋養(yǎng)層干細(xì)胞（TSCs）共培養(yǎng)可體外自發(fā)組裝成ETS胚胎，此ETS胚胎雖然可重現(xiàn)出類似正常早期胚胎發(fā)育的前羊膜腔形成-中胚層發(fā)育-原始生殖細(xì)胞發(fā)育等關(guān)鍵事件，但是其并不能經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程（epithelial–mesenchymal transition ，EMT）形成原腸胚，ETS胚胎發(fā)育潛力的不足是否由于此共培養(yǎng)體系中缺乏可發(fā)育為原始內(nèi)胚層的VE組分呢？在此體系中加入VE組分是否可擴(kuò)大ETS胚胎的發(fā)育潛力呢？
為了探究上述疑問，Magdalena Zernicka-Goetz教授團(tuán)隊(duì)將ESCs、TSCs與胚外內(nèi)胚層來源的XEN cells共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)此三種細(xì)胞亦可自發(fā)重組為ETX胚胎，此ETX胚胎除可發(fā)生前羊膜腔形成-中胚層發(fā)育-原始生殖細(xì)胞發(fā)育過程，還可繼續(xù)經(jīng)歷EMT及終末內(nèi)胚層發(fā)育過程，形成原腸胚樣結(jié)構(gòu)。ESCs、TSCs與XENs細(xì)胞可體外自發(fā)組裝成ETX胚胎
研究人員將ESCs、 TSCs及XENs細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液共培養(yǎng)于倒三角的微孔板中，共培養(yǎng)96h后發(fā)現(xiàn)：約70%的圓柱形結(jié)構(gòu)由ESCs、 TSCs及XENs三種細(xì)胞構(gòu)成，其中的29.8%僅包含一個TSCs和ESCs組分，并且外層由一層XENs細(xì)胞包繞，稱為ETX胚胎。通過進(jìn)一步比較ETX胚胎與E5.5正常發(fā)育胚胎各組分的形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量以及不同細(xì)胞譜系標(biāo)志分子的表達(dá)（Oct4標(biāo)記胚胎組分、Tfap2c標(biāo)記胚外外胚層組分、Gata6標(biāo)記VE組分），結(jié)果二者的上述各項(xiàng)參數(shù)均無顯著差異；表明體外培養(yǎng)的ESCs、TSCs和XENs細(xì)胞可自發(fā)組裝為胚胎樣結(jié)構(gòu)，即ETX胚胎（圖1）。
圖1.ESCs，TSCs和XENs可體外自發(fā)組裝為ETX胚胎
XENs組分的功能區(qū)域化
與正常發(fā)育胚胎類似，ETX胚胎同樣可發(fā)生ESCs和TSCs交界處中胚層和原始生殖細(xì)胞標(biāo)志分子的不對稱表達(dá)，并且XENs可發(fā)揮VE組分的部分功能：形成ESTs和TSCs組分中間的基底膜（Laminin陽性），并伴隨前羊膜腔的整合消失。
小鼠胚胎發(fā)育E5.25時(shí)，胚胎部分的VE由鱗形和方形細(xì)胞混合而成，至E6.75，其均變成了鱗形細(xì)胞，此時(shí)胚外外胚層部分的VE則主要由方形細(xì)胞組成。與此類似，體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎ESCs部分的XENs也主要呈現(xiàn)鱗形，而TSCs部分的XENs則仍然保持方形。XENs與VE細(xì)胞分布和形態(tài)的相似性也進(jìn)一步表明XENs可以某種程度模擬VE的生理作用（圖2）。
圖2. ETX胚胎的XENs層分布與正常胚胎類似
正常小鼠胚胎發(fā)育的VE功能區(qū)域化會誘導(dǎo)外胚層前后軸Nodal信號的不對稱表達(dá)，而連續(xù)觀察體外培養(yǎng)D4至D5的ETX胚胎也同樣發(fā)現(xiàn)：Nodal信號在ESCs區(qū)域的表達(dá)由基本無差異變?yōu)椴粚ΨQ高表達(dá)于后軸；同時(shí)前臟側(cè)內(nèi)胚層（anterior visceral endoderm ，AVE）特異標(biāo)志分子Lefty1及胚胎前后軸形成調(diào)節(jié)分子Otx2的表達(dá)模式與正常胚胎也非常類似。上述結(jié)果表明ETX胚胎的XENs層發(fā)生功能區(qū)域化，并且可模擬正常發(fā)育胚胎AVE的特異發(fā)生：即其可在ESCs組分T/Brachyury與Nodal陽性區(qū)域的對側(cè)誘導(dǎo)AVE相應(yīng)標(biāo)志分子的特異表達(dá)（圖3）。
圖3. ETX胚胎XENs層區(qū)域化分布
小鼠原腸胚形成階段，T/Brachyury陽性細(xì)胞可發(fā)生EMT并遷移至外胚層與VE之間。體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎亦可發(fā)現(xiàn)：瓶形的T/Brachyury陽性細(xì)胞其細(xì)胞核平行于基底膜，并且高表達(dá)Snail、Vimentin、Mmp9等EMT相關(guān)標(biāo)志分子。進(jìn)一步實(shí)時(shí)跟蹤發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長，ETX胚胎ESCs與TSCs交界處T/Brachyury陽性細(xì)胞極性改變，并且由瓶形的具備遷移特性的細(xì)胞逐漸變成方形的間質(zhì)細(xì)胞；此外，T/Brachyury陽性區(qū)域外包繞的Laminin陽性的基底膜也被打破，T/Brachyury的表達(dá)與基底膜的打破均受Wnt信號通路調(diào)控。上述發(fā)現(xiàn)表明：與正常發(fā)育胚胎類似，ETX胚胎同樣可發(fā)生EMT-細(xì)胞遷移過程（圖4）。
圖4. 原腸胚樣的ETX胚胎可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化
ETX胚胎可發(fā)育出軸向中胚層和終末內(nèi)胚層
隨后，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)D5至D6的ETX胚胎XENs層及某些ESCs細(xì)胞表達(dá)終末內(nèi)胚層標(biāo)志分子Foxa2，而共表達(dá)Foxa2和T / Brachyury的細(xì)胞位于胚胎后軸遠(yuǎn)端，E7.0時(shí)其會發(fā)育為前原條。上述研究表明：原腸胚階段的ETX胚胎其中胚層發(fā)育與正常胚胎非常類似（圖5）。
圖5. 原腸胚樣的ETX胚胎軸向中胚層的特異形成
正常情況下，前原條內(nèi)的終末內(nèi)胚層細(xì)胞逐漸與VE整合并替代，而類原腸胚階段的ETX胚胎同樣也可發(fā)生類似的發(fā)育事件：體外培養(yǎng)D5時(shí)，ESCs組分與XENs組分之間共表達(dá)Foxa2和Sox17的細(xì)胞與XENs組分接觸；D6時(shí)XENs組分中開始出現(xiàn)Foxa2陽性的終末內(nèi)胚層細(xì)胞，而D6晚期，ESCs來源的終末內(nèi)胚層細(xì)胞已經(jīng)大量取代XENs組分，進(jìn)一步證明原腸胚樣的ETX胚胎不僅可發(fā)育出中胚層，也可以發(fā)育出終末內(nèi)胚層（圖6）。
圖6. 原腸胚樣的ETX胚胎可發(fā)育出終末內(nèi)胚層
原腸胚樣的ETX胚胎基因表達(dá)模式與小鼠正常發(fā)育E7.0階段類似
為了進(jìn)一步證明原腸胚樣的ETX胚胎與正常發(fā)育胚胎的相似性，作者將體外培養(yǎng)D5的ETX胚胎中T / Brachyury陽性細(xì)胞（side2）與陰性細(xì)胞（side1）分別分離出來進(jìn)行深度測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2群細(xì)胞的基因表達(dá)模式很不相同；通過進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因，證明side1的表達(dá)模式更接近前軸，side2則與后軸更相似。鄰域連接樹分析更精細(xì)的表明：side2的表達(dá)模式與E7.0的胚胎后軸更接近，side1則更接近E7.5的胚胎前軸。這些結(jié)果更好的佐證了：體外自發(fā)重組的ETX胚胎可模擬正常生長發(fā)育的原腸胚形成（圖7）。
圖7. 原腸胚樣的ETX胚胎前后軸表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄譜與正常原腸胚整體相似
總結(jié)和展望
本文作者在前期體外自發(fā)重組ETS胚胎的基礎(chǔ)上，加入了原始內(nèi)胚層組分（XENs細(xì)胞），同樣發(fā)現(xiàn)ESCs、TSCs和XENs三種干細(xì)胞可體外自發(fā)重組為ETX胚胎，擴(kuò)大了此胚胎的發(fā)育潛力：ETX胚胎不僅胚胎形態(tài)和基因表達(dá)模式與正常發(fā)育胚胎相似，還可以序貫發(fā)生軸向中胚層及終末內(nèi)胚層特定分化等原腸胚形成過程中的重要事件，為研究相應(yīng)時(shí)間-空間上的多胚層對話和潛在分子機(jī)制提供了有效的離體模型。但此模型依然存在不足：首先，細(xì)胞進(jìn)入中胚層時(shí)并不伴隨T / Brachyury陽性信號均勻分布；其次，ETX胚胎雖然可形成原腸胚，但是其最終結(jié)構(gòu)并不完整；值得注意的時(shí)，即便是正常發(fā)育的胚胎，在體外培養(yǎng)時(shí)其形成原腸胚的結(jié)構(gòu)也不如體內(nèi)完善，提示此過程的發(fā)生機(jī)制仍然需要更多研究來揭示。相信共培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化和擴(kuò)展，共培養(yǎng)組分的不斷豐富，早期胚胎發(fā)育的黑匣子會逐漸被解析。
