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METTL3介導的m6A修飾在生物節(jié)律、DNA損傷應答、干細胞的自我更新和多能性調控、母源?合子轉換、果蠅神經功能調節(jié)與性別決定、小鼠早期胚胎發(fā)育等真核生物的各種生物學過程和個體發(fā)育中發(fā)揮著非常重要的作用。RNA甲基修飾酶和結合蛋白及其參與RNA 代謝加工的發(fā)現，提示RNA甲基化修飾具有重要生物學功能。

脊椎動物中，造血干細胞最初由特化的生血內皮通過內皮?造血轉化過程(EHT)產生于胚胎期主動脈?性腺?中腎區(qū)，隨后向血組織遷移并進行擴增，向胸腺遷移發(fā)育為淋系細胞，最后向骨髓(小鼠和人)或腎髓(斑馬魚)遷移以維持終生造血。通過 m6A 抗體進行MeRIP-seq和m6A單堿基分辨率的 miCLIP-seq測序技術，繪制了斑馬魚胚胎發(fā)育的m6A修飾精細圖譜，發(fā)現m6A通過特異性修飾內皮?造血轉化過程中的關鍵基因notch1a，招募結合蛋白YTHDF2降解mRNA，抑制了Notch信號通路，使得內皮?造血轉化過程有序發(fā)生，促進內皮細胞轉化為造血干/祖細胞(HSPCs)。在mettl3缺陷的斑馬魚胚胎中，m6A修飾水平顯著降低，notch1a無法正常降解使得Notch信號通路持續(xù)激活，最終導致內皮細胞無法正常轉化為造血干/組細胞。此外，Mettl3 敲除小鼠胚胎中也表現出相似的表型。這些結果揭示mRNA m6A甲基化修飾在脊椎動物造血干細胞命運決定中的調控機制，闡釋RNA的表觀修飾在血液發(fā)育中的關鍵作用。

2.2 RNA 甲基化修飾m6A調控精子發(fā)生

由于Mettl3敲除會導致小鼠早期胚胎致死，Mettl3條件敲除介導的m6A修飾在哺乳動物體內組織發(fā)育中的生物學功能還不清楚。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的同源重組技術和 Cre-loxP系統(tǒng)成功地建立了生殖細胞(Vasa-Cre)中特異性敲除Mettl3 的小鼠(Mettl3^CKO)模型，并利用該模型系統(tǒng)地研究了METTL3介導的m6A修飾在小鼠精子發(fā)生過程中的重要作用和調控機制。通過 H&E(蘇木素?伊紅)染色、免疫熒光染色、核染色體鋪片等研究表明，Mettl3敲除會抑制小鼠精原干細胞分化和減數分裂起始過程，最終導致雄性小鼠不育。通過 RNA-seq、m6AmiCLIP-seq和生物信息學分析發(fā)現，Mettl3 缺失會導致m6A水平下降，引起與精原干細胞維持和分化、細胞周期和減數分裂相關基因的RNA可變剪接異常和生殖細胞整體基因表達的紊亂，最終導致精子發(fā)生過程受阻，說明RNA甲基轉移酶 METTL3介導的m6A修飾在哺乳動物小鼠精子發(fā)生過程中的重要生物學功能。

在小鼠生殖細胞中用Vasa-Cre特異性敲Mettl3或者Mettl14會導致m6A水平下降，引起精原干細胞增殖和分化相關基因轉錄物的翻譯功能失調，精原干細胞逐漸耗盡；利用 Stra8-GFPCre同時敲除Mettl3和Mettl14，會破壞精子發(fā)生過程中單倍體特異性基因的翻譯，最終導致精子形成受阻。而雄性m6A去甲基酶Alkbh5^-/-小鼠也出現睪丸變小、生精異常、精子活力異常等表型；同時在發(fā)育至Ⅶ期的生精小管中檢測到初級與次級精母細胞數量顯著增加，粗線精母細胞與成熟精子的數量明顯減少，同時伴有細胞凋亡。Ythdc2敲除小鼠也發(fā)生在精細胞減數分裂前期出現過度的細胞凋亡，從而導致睪丸變小及精子發(fā)育異常。YTHDC2的m6A結合能力及其3′→5′解旋酶活性對于維持精子發(fā)育過程中減數分裂相關基因的正確表達模式具有重要調控功能。上述研究提示RNA m6A甲基化修飾的動態(tài)平衡是配子(精子)發(fā)育過程中重要的調控因素。

2.3 RNA 甲基化修飾 m6A 調控腦發(fā)育

m6A修飾在神經系統(tǒng)的發(fā)育以及功能的行使中也發(fā)揮不可替代的調控作用。m6A RNA甲基化修飾在中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育以及功能行使中發(fā)揮重要的調控作用。敲除Ime4基因的果蠅可以出生并存活，但果蠅壽命變短，并表現出明顯的行為異常，提示m6A修飾的缺失影響果蠅神經系統(tǒng)功能。在小鼠的中樞神經系統(tǒng)中特異地敲除Mettl14基因會嚴重影響小鼠大腦皮質的發(fā)育。小鼠中Ythdf2基因缺失導致m6A整體水平升高，使得參與神經干細胞分化和神經元軸樹突形成的重要因子無法正常進入RNA降解途徑，從而導致大腦皮層神經干細胞不能正常地進行不對稱分裂，造成神經前體細胞的大量缺失、嚴重影響神經元的分化，致使小鼠的前腦大腦皮層發(fā)育緩慢。除大腦皮層外，小腦的RNAm6A甲基化模式和水平尤為突出。m6A甲基化與去甲基化的動態(tài)過程貫穿于小腦出生后發(fā)育的整個過程，且在低壓低氧環(huán)境下Alkbh5基因缺失造成參與小腦發(fā)育調控進程基因的m6A水平紊亂，加快了RNA出核過程，從而導致小腦發(fā)育明顯滯后。

通過Cre-loxP系統(tǒng)在小鼠的中樞神經系統(tǒng)中特異性地敲除Mettl3基因，以探究m6A甲基化修飾對中樞神經系統(tǒng)發(fā)育的影響。在中樞神經系統(tǒng)特異地敲除Mettl3導致小鼠在哺乳期表現出嚴重的運動功能障礙，并導致死亡。解剖和病理切片檢測發(fā)現由Mettl3敲除引起的 m6A甲基化修飾的缺失嚴重影響大腦皮層和小腦的發(fā)育，導致大腦皮層偏薄和小腦發(fā)育不良。m6甲基化修飾的缺失引起小腦內顆粒神經元分化和成熟過程中基因表達調控紊亂，導致新生的顆粒神經元大量凋亡，揭示了 METTL3介導的m6A修飾在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用。

除了對中樞神經系統(tǒng)發(fā)育的影響，m6A修飾也參與成體的神經系統(tǒng)調控，神經軸突損傷會促使神經細胞內m6A修飾水平提高，進而提高包括軸突再生相關基因在內的一系列基因的蛋白質翻譯效率。

2.4 RNA甲基化修飾m6A與RNA代謝

目前越來越多的研究表明，從細胞核內的前體mRNA 加工、mRNA表達到細胞質的 mRNA翻譯和降解，m6A幾乎參與調控了RNA加工代謝的各個過程。在細胞核內，m6A 通過結合蛋白YTHDC1招募SRSF3，參與調控前體mRNA的選擇性剪接過程；通過調控最后一個外顯子的選擇性剪接，參與調控腺苷多聚體的多樣性；而m6A修飾酶體系METTL3、ALKBH5和 YTHDC1還被發(fā)現參與調控mRNA的出核過程。在細胞質中，m6A調控翻譯的機制十分多樣，既有通過YTHDF1-eIF3通路調控mRNA翻譯效率的方式，也存在 IGF2BP家族蛋白介導的調控過程，并且在應激狀態(tài)下，m6A參與一類不依賴于5′ 帽子的翻譯調控通路；并且其對mRNA穩(wěn)定性的調控也存在不同的通路，既包括通過YTHDF2將 mRNA招募至P小體降解mRNA的調控方式，近期有報道指出IGF2BP家族蛋白通過特異性結合m6A修飾mRNA維持其穩(wěn)定性。此外，m6A還可通過調控RNA的二級結構調控其代謝過程。

2.5 RNA甲基化修飾m5C的生物學功能

近年來越來越多的研究表明，mRNA上的m5C修飾在RNA加工代謝及正常生理過程中發(fā)揮重要的調控作用，包括RNA代謝、干細胞分化及應激反應等過程。對小鼠胚胎干細胞和大腦的研究表明，在干細胞分化不同時期，m5C修飾水平和分布明顯不同。在擬南芥中，mRNA上的m5C修飾呈現組織特異性，且對植物發(fā)育非常重要。擬南芥中的m5C甲基轉移酶TRM4B突變體植株的根頂端分生組織細胞分裂受阻，從而導致除根較短，并且對氧化應激非常敏感。

在讀碼器和消碼器的共同作用下，RNA m6A修飾水平得以實現動態(tài)調控，并通過招募不同的結合蛋白實現對RNA加工過程的精細調控。雖然該研究領域還有部分觀點存在不確定性，需要在將來投入更多的研究工作來證明。目前通過改造DNA聚合酶實現m6A修飾位點錯配以檢測單堿基精度的m6A轉錄組修飾水平，以及借助納米孔測序直接檢測轉錄本上鑒定 RNA修飾的技術，已成為領域內最熱門的研究熱點。該技術的實現，將成為闡明m6A修飾動態(tài)調控機制及其分子功能的核心關鍵。

對于m5C修飾，更為精確的m5C檢測方法的開發(fā)對于高可信度的m5C修飾譜的建立至關重要。同樣，納米孔測序對于m5C的研究也非常重要。其次，m5C的書寫器、閱讀器和擦除器的研究才剛剛開始，這些方向的發(fā)展將為揭示RNA m5C修飾的生物學功能提供線索。此外，由m5C氧化產生的5-羥甲基?胞嘧啶(hm5C)等新型RNA修飾類型的特征及功能也有待未來進行深入研究。

除了m6A與m5C之外，RNA新型化學修飾也是近期研究的熱點。最近研究人員發(fā)現 mRNA上還存在另外一種新型甲基化修飾——m1A，研究人員利用特異識別m1A的抗體來富集含有m1A的RNA片段并結合高通量測序，獲得了全轉錄組水平的m1A甲基化譜圖，發(fā)現m1A特異富集在5′非翻譯區(qū)(5′UTR)區(qū)域；并且，還發(fā)展出單堿基分辨率的m1A 檢測方法，發(fā)現核編碼和線粒體編碼轉錄本上存在不同類型的m1A甲基化組。目前對于 mRNA上m1A 修飾的研究仍然處于起步階段，例如5′UTR的m1A甲基轉移酶，m1A修飾參與RNA代謝調控的具體分子機制，m1A修飾是否像m6A修飾一樣在多個生物學過程中發(fā)揮調控作用等都有待未來進行深入的研究。

綜上所述，以m6A為代表的RNA修飾在RNA加工及生命過程中扮演著重要的調控作用(表1)。隨著研究的深入及先進技術的開發(fā)，RNA 修飾調控基因表達的生物學過程與機制一定會更加清楚。