做SDS-PAGE凝膠電泳準備工作：
1. 前天晚上先制備好兩塊跑電泳用的SDS-PAGE凝膠板于4℃下備用（配膠需參照試劑盒、操作的規(guī)范性、凝膠時間下層1h，上層30mim、每次加入試劑時均需混勻、插膠梳時需要從一側(cè)緩緩向另一側(cè)插入，避免出現(xiàn)氣泡、在倒去壓膠所用ddH2O后，應倒置瀝干水，方可加入上層膠，注意控制加入速度）； 2. 制備冰盒備用、取離心管支架、1.5ml離心管、0.6ml離心管備用、鑷子備用； 3. 提取蛋白及蛋白定量，4℃離心30min（提前預冷30min）；（此步及下續(xù)均于冰上操作）
4. 吸取上清液于對應已標記好的1.5離心管中，置冰上離心管架備用；
5. 每個樣品蛋白提取液對應8個0.6ml離心管，對應標記(標記內(nèi)容應予各自的初管一致)為1~8備用；
6. 每0.6ml離心管分裝100ul蛋白提取液，留對應倆管下續(xù)操作，其余均封口，再置于-80℃下保存；
7. 給剩下的倆管中各加入25ul loading buffer（5X）（1：4稀釋成1X），吹打混勻，閉蓋、放在加熱器上100℃下煮沸10min（提前預熱到100℃），后離心、于室溫下冷卻到室溫；
8. 組裝好電泳膠板玻板、檢漏、插入電泳槽內(nèi)、倆玻板間加新配電泳液直至沒出；
9. 小心拔膠梳，加樣：mark 加5ul 、其余各樣品加10ul; 10. 80V電壓先跑30min（以mark徹底分開為準）、再轉(zhuǎn)110V電壓跑一個小時（以紅色mark標記下僅剩下倆條帶為準）；
做轉(zhuǎn)膜前的準備工作：
1. 預先配好轉(zhuǎn)膜液（1X）及分裝好PVDF膜激活液，置于4℃下預冷備用； 2. 裁剪好適合尺寸濾紙并濕潤備用；準備好：平口鑷子、切膠板、盛轉(zhuǎn)膜液的白色瓷盒子、盛激活液的小盒子、轉(zhuǎn)膜用壓合器、小剪刀備用；
3. 到適量轉(zhuǎn)膜液于白瓷盒中備用，取下已電泳好的玻璃板，用切膠板小心分開倆玻璃板，留上附有膠的玻板，切去多余的膠(切平整)，測量剩余膠塊尺寸記錄備用，并用切膠板從膠的有mark側(cè)一角小心的鏟起，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液中（輕柔，不可弄破）；
4. 以膠塊略小尺寸裁剪好PVDF膜（一角剪去以作標記），并將其小心平鋪于已倒入了激活液的塑料盒子中，激活1min（不可出現(xiàn)氣泡）；再用平口鑷將其夾入轉(zhuǎn)膜液中平衡數(shù)分鐘，同時將準備好的濾紙放入轉(zhuǎn)膜液中備用；
5. 打開轉(zhuǎn)膜壓合器，黑板面先放好海綿，將轉(zhuǎn)膜液中的膠片轉(zhuǎn)移到濕潤的濾紙上（動作輕柔、并用切膠板于下端支持），馬上連同濾紙小心放在黑面海面上，小心用鑷子夾取PVDF膜一角，并將缺口側(cè)對齊mark無氣泡敷好；
6. 與膜上蓋好另一片濾紙、海綿，并小心地合上轉(zhuǎn)膜壓合器，固定，黑面和黑的配好組裝裝；
7. 加轉(zhuǎn)膜液并將白瓷盒中轉(zhuǎn)膜液也加入電泳槽，直至與其上肩部齊平，合蓋；
8. 110V 、120min轉(zhuǎn)膜；
封閉
1. 洗膜：用ddH2O室溫漂洗5min（注意正反），以洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，以防止后續(xù)的抗體結(jié)合（此步及下步在搖床上）；
2. 封閉：取一步轉(zhuǎn)印膜，正面朝上，置于封閉液中，搖床、室溫封閉1h； 剪膜：封閉完畢后用剪刀小心剪下含目的條帶的PVDF膜，依次轉(zhuǎn)入專用盒子中（分別做好標記），以備下步操作；
敷一抗（1：1000）:于4℃下進行蛋白膜和一抗的結(jié)合反應，以緩解一抗衰減速度；（敷一扛過夜）
洗膜：回收一抗剩余抗體于特定管中，標記，4度保存，后分別倒入適量洗膜液（浸沒即可），搖床，5min，棄洗膜液，再倒入新的洗膜液（如此5次），最后一次后小心甩干洗膜液，進入下步操作； 敷二抗（1：1000）：向反應槽中分別加入二抗稀釋液（只要浸沒即可），于室溫下反應1h；
洗膜：回收二抗剩余抗體于特定管中，標記，4度保存，后分別倒入適量洗膜液（浸沒即可），搖床，5min，棄洗膜液，再倒入新的洗膜液（如此5次），最后一次后小心甩干洗膜液，進入下步操作；
掃膜：
（1） 配顯影液（BeyoECL Star）:A液：B液=1:1混合(500ul/膜)（此步需避光）；
（2） 提前開啟掃膜儀預冷到-30℃(需打開程序)；
（3） 將目標條帶正面轉(zhuǎn)移至操作臺目標位置，均勻滴加顯影液于表面，掃膜拍照；
