動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致冠狀動脈疾病發(fā)病和患者死亡的主要原因，迄今仍未闡明其確切的病因及發(fā)病機制[1]。其主要治療藥物是調脂、抗凝及溶栓藥物，治療效果也不夠理想[2]。中醫(yī)無“動脈粥樣硬化”的病名，但可歸為“胸痹”
1 材料與方法
1.1 數(shù)據庫
1.2 方法
1.2.1 化學成分和疾病的候選靶點預測 在TCM-IP平臺中藥材數(shù)據庫中對心可舒片組方中藥丹參、葛根、三七、山楂和木香進行化學成分信息收集，包括CAS號、中文名稱、英文名稱、分子式、相對分子質量、藥理作用，并建立心可舒片的化學成分信息數(shù)據庫。利用TCM-IP平臺開源軟件OpenBabel提取心可舒片化學成分MACCS分子指紋，通過化學成分二維結構（.mol）與FDA上市藥物進行化學指紋特征比對，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法進行相似性打分，取打分系數(shù)＞0.8所得的藥物靶點為此次研究所需要的作用的潛在靶點，建立心可舒片候選靶點信息數(shù)據庫。在疾病/癥狀靶點數(shù)據庫，以“atherosclerosis”作為疾病或癥狀關鍵詞進行檢索，提取心可舒片中干預AS的藥物名稱、藥物療效、藥物靶點的基因和蛋白質相關信息，作為候選靶點來源。
靶點網絡。通過TCM-IP平臺的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）數(shù)據庫，獲得心可舒片作用的潛在靶點與“atherosclerosis”疾病靶點之間的PPI信息并構建相互作用網絡，以“節(jié)點連接度（degree）≥2倍中位數(shù)”為篩選條件，選取心可舒片靶點-疾病蛋白互作網絡的節(jié)點（hubs）；接著，以“degree≥中位數(shù)”“緊密度（closeness）和介度（betweenness）均大于等于其中位數(shù)”為條件[11]，選取心可舒片干預AS的候選靶點；然后，通過對上述候選靶點所參與的功能和通路進行分析，并構建“復方-中藥-成分-靶點-通路”的多層次網絡關聯(lián)圖。
1.2.3
2 結果
2.1 心可舒片所含成分及其預測靶點信息
絡中degree值最高的中藥是山楂，degree值排在前10位的成分是棕櫚酸、亞油酸、蔗糖、熊果酸、琥珀酸、花生酸、庚酸、壬酸、二十一碳酸和烏藥酸，見圖1。
2.2 心可舒片預測靶點生物信息學分析
2.3 心可舒片干預AS候選靶點網絡構建
通過TCM-IP平臺的PPI相互作用數(shù)據庫，建立心可舒片藥物靶點與AS靶點之間的相互作用網絡，根據條件篩選出核心靶點461個，其中紅色代表潛在藥物靶點（putative drug target），灰色代表其他。根據degree排序僅顯示排名前100的靶點得到心可舒片干預AS的候選靶點網絡，見圖3。節(jié)點的大小與degree呈正比關系，節(jié)點的degree值越大，說明這個節(jié)點在網絡中的作用越大。其中，degree值排在前10位的基因分別是B4GALT4、B4GALT2、PRKCD、GCK、GNB1、ADCY2、CASK、ADCY5、PRKAA2、SSTR1。其中網絡中連接度最高的節(jié)點為B4GALT4基因，表明B4GALT4相對應的蛋白在心可舒片干預AS的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。對前10位的基因進行Pathway的通路分析，選取Pathway的P≤0.05為有意義的通路。結果顯示與鈣調蛋白、G蛋白、γ-氨基丁酸通路密切相關，見圖4。
2.4 心可舒片干預AS關鍵靶點生物信息學分析及“成分-靶點-通路”多維網絡關系構建
對候選靶點進行GO富集分析，P值排名前20的候選靶點功能信息主要涉及MAPK級聯(lián)反應、免疫過程、氨基酸代謝等多個生物學過程；胞外體、線粒體、髓鞘等多個細胞組分蛋白激酶結合、ATP結合和藥物應答等多個分子功能（圖5-A）；對候選靶點進行Pathway富集分析，P值排名前20的候選靶點通路信息主要涉及內分泌系統(tǒng)中甲狀腺激素、雌激素，神經系統(tǒng)中神經傳導、谷氨酸能突觸，免疫系統(tǒng)中趨化因子，循環(huán)系統(tǒng)和細胞生長和死亡等通路（圖5-B）。通過上述分析，借助TCM-IP平臺建立心可舒片干預AS“成分-靶點-通路”多維網絡，見圖6。心可舒片干預AS的成分共80個，丹參中15個、三七中37個、山楂中19個、葛根中7個、木香中9個。研究表明，丹酚酸B可通過抗氧化、抗炎和抑制TLR4-NF-κB-TNF-α通道，而影響AS[13]；三七總皂苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1均有抗AS作用[14-16]；槲皮素可激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路，起到抗AS作用[17]；棕櫚酸能夠升高血漿游離脂肪酸水平，熊果酸可能通過調節(jié)血脂，抑制炎癥反應以及降低氧化應激損傷而對AS大鼠表現(xiàn)出一定的保護作用[21]；染料木黃酮可以結合雌激素受體進而抑制血管內皮細胞和平滑肌細胞內細胞核因子-κB（NF-κB）活性及炎性細胞因子分泌，減少血管內皮細胞及平滑肌細胞增殖和轉移，抑制AS的形成[22]。
2.5 心可舒片干預AS網絡機制探討
對“成分-靶點-通路”網絡中取P值排名前5的通路內分泌系統(tǒng)（endocrine system）、甲狀腺激素信號通路（thyroid hormone signalingpathway）、神經系統(tǒng)（nervous system）、雌激素受體信號傳導通路（estrogen signaling pathway）和趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）中富集的基因進行韋恩分析，見圖7。其中，5條通路的共有基因13個：HRAS、RAF1、PLCB2、MAPK3、PLCB3、KRAS、AKT1、PIK3R1、AKT3、PRKACA、PIK3CG、MAP2K1、SRC。將這13個基因帶入KEGG Mapper，分析得到共有機制，結果顯示心可舒片干預AS的機制與干預PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑密切相關，見圖8。
3 討論
AS是危害人類健康的主要疾病之一，隨著現(xiàn)代醫(yī)學治療方法的不斷發(fā)展，其病死率呈現(xiàn)下降趨勢，但死亡總數(shù)仍在不斷增加[23]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為“損傷反應學說”是AS發(fā)病的主要機制。其發(fā)病機制的主要過程首先是內皮損傷，其次是脂質積聚[3]，而粥樣斑塊的形成是動脈對內皮損傷反應的結果。AS屬于中醫(yī)“胸痹”“脈痹”“真心痛”等病癥范疇，氣滯血瘀證是其主要證候之一[3]。心可舒片由丹參、葛根、三七、山楂、木香5味藥物組成，具
有活血化瘀、行氣止痛的功效。2017年發(fā)布的《動脈粥樣硬化中西醫(yī)結合診療專家共識》中明確了心丹參、山楂和丹參、葛根藥對于大鼠AS的發(fā)生發(fā)展具有良好的干預作用，作用與調節(jié)血脂水平、強抗氧化作用以及增強內皮功能有關[25]；臣藥葛根中黃酮類有效成分降低了AS病變內巨噬細胞凋亡，抑制AS斑塊的進展[26]。但國內外對心可舒干預AS的研究尚不足。因此，探究心可舒片用于AS的藥效和機制研究對于心可舒片的進一步開發(fā)和應用具有十分重要意義。
和內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等多個靶點。Akt磷酸化后可以促進eNOS活化，使內皮細胞產生NO增多，NO具有抑制血小板聚/ eNOS途徑在AS的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，抑制該途徑，可延緩AS的形成及進展。研究表明，其中丹酚酸B可通過PI3K-Akt信號通路干預大鼠心肌缺血再灌注損傷[34]；人參皂苷Rg1通過PI3K/Akt/eNOS信號通路調控異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[35]，但對于AS中信號通路的影響尚未見報道。
絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs可將細胞外刺激信號轉導至細胞內及核內，而引起細胞的增殖、分化、轉化及調亡等各種生物學反應[36]。ERK是MAPKs中的重要成員之一，可被炎性刺激激活，通過相應的下游信號分子調節(jié)多種內皮細胞的遷移、分化和增殖。Raf以級聯(lián)反應的方式調節(jié)相關靶蛋白，形成經典Raf/MEK/ERK途徑。Raf/MEK/ERK途徑可由活性氧（ROS）、Ca2+、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等激活，并參與體內多種生理生化功能，對細胞生長、增殖、分化、凋亡均有影響[37]。Raf/MEK/ERK途徑目前在腫瘤治療、神經保護方面研究較多，對抑制Raf/MEK/ERK途徑來抑制腫瘤的發(fā)展己經成為腫瘤開發(fā)藥物的新方向，但鮮有其在AS方面的研究。
PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑廣泛存在于體內各種細胞，在血管內皮細胞的多種功能中起重要作用[38]。本研究結果首次提示心可舒片通過對PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑的共同調節(jié)，保護血管內皮細胞，從而達到干預AS的效果，對于心可舒片的開發(fā)和應用具有十分重要意義。心可舒片干預AS的藥效作用網絡、方劑配伍關系仍需在病證背景下做進一步的實驗驗證。
參考文獻（略）
來 源：李曉宇，徐 男，黃娜娜，吳成勝，劉閏平，郭文鶴，李曉驕陽，孫 蓉. 整合藥理學方法的心可舒片干預動脈粥樣硬化作用網絡機制探討 [J]. 中草藥, 2018, 49(15):3463-3470.
