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圖片來源：CDC

2019年2月11日，《Nature Neuroscience》刊登了威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Zhao Xinyu團(tuán)隊(duì)的最新研究工作[1]，他們發(fā)現(xiàn)了線粒體融合可以改善FMRP缺失導(dǎo)致的神經(jīng)元發(fā)育受損，Htt可以介導(dǎo)FMRP調(diào)控線粒體融合和樹突成熟，提示了FMRP和HTT在FXS發(fā)病機(jī)制中的相互作用，提高了人們對(duì)該領(lǐng)域的認(rèn)知。

Zhao Xinyu 圖片來源：

University of Wisconsin-Madison

1、FMRP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的成熟過程至關(guān)重要

首先，作者通過DCX-Cre^ERT2鼠（DCX啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)Cre酶）、TdT reporter鼠（Cre依賴表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白的report鼠）以及Fmr1^loxp/+鼠雜交獲得cKO鼠（tamoxifen誘導(dǎo)條件性敲除FMRP鼠，圖1a）。他們對(duì)6周齡的cKO鼠和對(duì)照鼠注射tamoxifen（TAM），并取注射后3d、7d、14d、28d、56d（對(duì)應(yīng)于新生神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵階段）的組織進(jìn)行分析[2]（圖1b），發(fā)現(xiàn)TAM誘導(dǎo)Cre重組酶在DCX+細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致FMRP在DCX+細(xì)胞中的選擇性缺失（圖1d-e）。

隨后，他們對(duì)海馬齒狀回顆粒下層（SGZ）的tdT+細(xì)胞數(shù)進(jìn)行量化（圖1c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP的選擇性缺失，使未成熟神經(jīng)元數(shù)量在最初階段有一個(gè)短暫的增加，而在發(fā)育成熟的最后階段則顯著性減少，最終導(dǎo)致新成熟神經(jīng)元數(shù)量減少（圖1f-m）。

圖1 FMRP選擇性缺失影響神經(jīng)元的發(fā)育過程

接下來，作者在FMRP-cKO鼠（Fmr1^loxp/y）和FMRP-cON鼠（Fmr1^loxp-Neo/y）[3]的DG區(qū)注射retro-pDcx-Cre和retro-flip-GFP混合病毒（圖2a-c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT鼠相比，注射后28天，cKO鼠的DCX+新生神經(jīng)元樹突復(fù)雜性、總長(zhǎng)度、分支點(diǎn)及端點(diǎn)的數(shù)量顯著降低；而在cON鼠中，由于FMRP恢復(fù)，改善了cON鼠的DCX+神經(jīng)元樹突形態(tài)的缺陷（圖2d-h）。這提示了在DCX+新生神經(jīng)元中FMRP的表達(dá)對(duì)樹突成熟的重要性。

進(jìn)一步，為了評(píng)估未成熟神經(jīng)元中FMRP缺失對(duì)新生神經(jīng)元突觸傳遞的功能影響，他們?cè)赾KO鼠的DG區(qū)注射retro-hSyn-Cre-GFP病毒，4-5周后，記錄GFP+神經(jīng)元的誘發(fā)動(dòng)作電位（AP）和微小自發(fā)性興奮性突觸后電流（mEPSCs），結(jié)果表明，未成熟神經(jīng)元中FMRP的缺失會(huì)影響其接受興奮性傳遞的能力（圖2i-n）。這些結(jié)果提示了，F(xiàn)MRP在神經(jīng)細(xì)胞成熟過程中的重要作用。

圖2 未成熟神經(jīng)元中FMRP缺失導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)育受損

2、FMRP缺失影響代謝過程

為了研究FMRP調(diào)控新生神經(jīng)元發(fā)育成熟的分子機(jī)制，作者將Fmr1-KO小鼠和Dcx-DsRed轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行雜交[4]。用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）分離小鼠DG區(qū)中的DsRed+細(xì)胞后（圖3a,b）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析出了與代謝相關(guān)的差異基因（圖3c,d）。神經(jīng)代謝高度依賴線粒體功能[5]，作者的研究發(fā)現(xiàn)，從Fmr1-KO鼠分離的海馬神經(jīng)元中，參與線粒體功能的幾個(gè)差異基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化，為證明這種變化與FMRP缺失有關(guān)，他們檢測(cè)了硝基酪氨酸水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，cKO小鼠的tdT+神經(jīng)元的硝基酪氨酸水平升高（圖3e,f）。

隨后，作者在Fmr1-KO鼠和WT鼠的DG區(qū)注射Retro-pCAG-mitoDsRed病毒來觀察新生神經(jīng)元中線粒體形態(tài)（圖3g），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP缺失的未成熟神經(jīng)元中線粒體碎片較多（圖3h,i）。這些結(jié)果提示了，未成熟神經(jīng)元中FMRP表達(dá)缺失會(huì)顯著影響代謝過程，這可能是由線粒體功能障礙引起的。

圖3 FMRP缺失影響代謝過程

3、線粒體融合改善FMRP缺失神經(jīng)元的成熟過程

接下來，科研人員用mitoDsRed和GFP轉(zhuǎn)染從Fmr1-KO鼠分離出的神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT相比，Fmr1-KO鼠神經(jīng)元中線粒體的縱橫比、膜電位均顯著降低（圖4a-d），這提示了FMRP缺失會(huì)損害小鼠神經(jīng)元線粒體功能。

線粒體可以通過分裂或融合發(fā)生頻繁的形態(tài)學(xué)變化[6]，因此他們假設(shè)FMRP缺失的神經(jīng)元線粒體縱橫比降低可能是由于裂變?cè)黾踊蛉诤蠝p少導(dǎo)致的，隨后作者用光電開關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一假設(shè)，即Fmr1-KO鼠神經(jīng)元中線粒體融合減少（圖4e-h）。

圖4 FMRP缺失的未成熟神經(jīng)元中線粒體融合受損

進(jìn)一步，他們用M1（可促進(jìn)線粒體融合，恢復(fù)線粒體管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)）處理Fmr1-KO和WT鼠神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線粒體融合的恢復(fù)顯著改善了FMRP缺乏導(dǎo)致的樹突成熟度受損現(xiàn)象（圖5）。

圖5 增強(qiáng)線粒體融合可改善FMRP缺陷的未成熟神經(jīng)元

4、HTT缺失導(dǎo)致線粒體融合基因表達(dá)減少以及樹突成熟度受損

接下來，作者研究了FMRP調(diào)控線粒體融合的機(jī)制。他們從BioGRID數(shù)據(jù)庫(kù)中找出最可能參與未成熟神經(jīng)元線粒體FMRP調(diào)控的靶點(diǎn)基因-Htt，隨后，評(píng)估了未成熟神經(jīng)元中HTT蛋白表達(dá)、Htt mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，cKO鼠DG區(qū)中tdT+神經(jīng)元的HTT免疫染色強(qiáng)度明顯降低（圖6a,b），此外，Fmr1-KO鼠DG區(qū)和原代海馬神經(jīng)元的Htt mRNA水平均顯著性降低（圖6c,d）。

進(jìn)一步，作者用慢病毒介導(dǎo)的shRNA感染海馬神經(jīng)元，干擾Htt，發(fā)現(xiàn)病毒感染神經(jīng)元HTT的mRNA水平和蛋白水平以及MFN2（線粒體融合蛋白2，介導(dǎo)線粒體外膜融合）和OPA1（視神經(jīng)萎縮1，介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合）的mRNA水平和蛋白水平均顯著降低（圖6e-l），此外，HTT敲低的海馬神經(jīng)元的樹突狀復(fù)雜性、長(zhǎng)度以及節(jié)點(diǎn)數(shù)量也顯著降低（圖6m-p）。這些數(shù)據(jù)提示了，未成熟神經(jīng)元中HTT缺失導(dǎo)致線粒體融合基因表達(dá)減少以及樹突成熟度受損，這與FMRP缺失導(dǎo)致的發(fā)育神經(jīng)元發(fā)育受損表型一致。

圖6 HTT缺失導(dǎo)致線粒體融合基因表達(dá)減少以及樹突成熟度受損

5、HTT表達(dá)增強(qiáng)可改善FMRP缺失神經(jīng)元的線粒體融合

為了檢驗(yàn)Htt降低是否與FMRP缺失神經(jīng)元中線粒體缺陷有關(guān)，作者利用CRISPR/dCas9技術(shù)進(jìn)行內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄激活[7]。他們將設(shè)計(jì)的十條sgRNA靶序列轉(zhuǎn)染Neuro2A細(xì)胞，篩選出能使內(nèi)源性Htt mRNA水平和HTT蛋白水平表達(dá)顯著性增強(qiáng)的sgRNA（圖7a,b）。隨后科研人員用篩選出來的sgRNA和dCas9-V164感染Fmr1-KO和WT鼠原代海馬神經(jīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KO和WT鼠神經(jīng)元中HTT蛋白表達(dá)水平就顯著升高，更重要的是，KO小鼠神經(jīng)元中HTT水平恢復(fù)到WT的水平（圖7d）。此外，內(nèi)源性Htt基因的激活提高了Fmr1-KO鼠神經(jīng)元中線粒體的縱橫比、降低了硝基酪氨酸水平（圖7d,f），并改善了神經(jīng)元的樹突復(fù)雜度（圖8a-c）。提示了，HTT是FMRP調(diào)控線粒體功能和神經(jīng)元成熟的核心。

圖7 HTT表達(dá)增強(qiáng)可改善FMRP缺失神經(jīng)元的線粒體融合

6、增強(qiáng)線粒體融合可改善Fmr1-KO小鼠行為缺陷

上述研究發(fā)現(xiàn)M1可以改善Fmr1-KO鼠神經(jīng)元中線粒體形態(tài)（圖4），接下來，作者利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（圖8e）、定位測(cè)試（圖8f）以及社會(huì)新奇度測(cè)試（圖8g）三種行為學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證M1可以改善Fmr1-KO鼠的行為缺陷（圖8d-g）。

最后，他們?cè)诔赡闣T小鼠的DG區(qū)注射慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲除HTT，并在21天后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)（圖8h）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HTT敲除小鼠表現(xiàn)出空間記憶和交往能力受損，而M1則可以改善這一現(xiàn)象（圖8i-k）。這表明缺乏FMRP或HTT的小鼠行為缺陷可以通過一種促進(jìn)線粒體融合的化合物來進(jìn)行修復(fù)。

圖8 增強(qiáng)線粒體融合可改善Fmr1-KO小鼠行為缺陷

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參考文獻(xiàn)：

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