在很早之前，研究人員就發(fā)現(xiàn)健康人血漿中的細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）分子是來自于造血系統(tǒng)的，有猜想表示，如果妊娠、器官移植、腫瘤等會釋放與正常細(xì)胞不同的DNA分子到血漿中，那去檢測這些與眾不同的DNA分子是不是就可以實現(xiàn)無創(chuàng)檢測和診斷呢？
果然在近幾年，以血液作為主要材料的液體活檢發(fā)展迅速，其中cfDNA（包含循環(huán)腫瘤DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、外泌體以及各種RNA等被廣泛應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前、器官移植檢測和腫瘤診療等領(lǐng)域。
圖1. 液體活檢的主要材料
通過對cfDNA的檢測分析可以了解DNA含量、完整性、甲基化、基因變異等信息，例如：基因單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphism, SNP)、拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)、結(jié)構(gòu)變異(structure variation, SV)等。DNA甲基化作為表觀遺傳重要的一種表現(xiàn)形式，具有分布廣、數(shù)量多、密度大等優(yōu)點，且具有組織特異性，能在不改變DNA序列的前提下改變遺傳表現(xiàn)。2016年，Nature子刊連發(fā)四篇新論文，預(yù)示了表觀遺傳分析用于臨床診斷和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的可行性。
那今天我們就為大家來介紹一下cfDNA甲基化與斷裂模式在液態(tài)活檢中的前沿研究及應(yīng)用。
DNA甲基化簡介與研究進展
DNA甲基化是一種共價修飾，主要是在胞嘧啶環(huán)第五號碳原子上加入一個甲基基團，即5-甲基胞嘧啶，簡稱5mC（5-methylcytosine），且主要是在CpG（CG序列密集區(qū)）的背景下發(fā)生。DNA甲基化是當(dāng)下應(yīng)用最廣泛的表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記，代表了一種注釋遺傳信息的復(fù)雜機制，盡管身體所有細(xì)胞的DNA序列都來源于一套遺傳信息，但不同的甲基化模式對生理過程有著不同的影響并且可能遺傳下去。
圖2. 甲基化示意圖
研究表明在妊娠和癌癥模型中，cfDNA與其組織來源的基因組DNA的甲基化特征高度一致。在臨床實踐中，DNA甲基化信息可以從實體瘤或患者血漿cfDNA中提取出來，表1中概述了最近利用這種DNA生物標(biāo)記物進行癌癥檢測的研究情況?？紤]到腫瘤的高度異質(zhì)性，圖中也包含來自于正常人的組織生物標(biāo)志物研究。
表1. 利用cfDNA進行檢測的相關(guān)研究
其中，Liu等人使用靶向亞硫酸氫鹽測序分析了cfDNA中選定的CpG位點用于癌癥診斷，通過使用TCGA數(shù)據(jù)庫中超過10000例的腫瘤樣本數(shù)據(jù)，針對每個癌種，將數(shù)據(jù)分為training(80%)、testing（20%）sets，前者用于選出癌種特異的甲基化位點，后者用于驗證；并在每個癌種中選出甲基化程度最高的3%的位點作為classifier；實際分類時，針對每個樣本，分別計算不同癌種的特異性位點甲基化程度求取平均值，哪一個對應(yīng)的CpG sites set甲基化程度的平均值最高，就將該樣本歸為該癌種，以利用甲基化信息實現(xiàn)組織溯源[16]。
DNA甲基化應(yīng)用及問題
在腫瘤中，常在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)異常的DNA甲基化模式，即抑癌基因的高度甲基化和原癌基因的低甲基化。在不同類型的癌癥患者血漿cfDNA中發(fā)現(xiàn)了大量基因的異常甲基化，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、肝細(xì)胞癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。通過對這些異常甲基化進行分析，我們可以了解到腫瘤的分級分期、侵襲轉(zhuǎn)移甚至生存期等相關(guān)信息[17]，另外，抑癌基因異常甲基化可以作為腫瘤表觀遺傳治療的靶標(biāo)。Chan等人的研究表明，可利用全基因組亞硫酸氫鹽測序測定血漿cfDNA，可以作為診斷多種癌癥的通用方法[18]。然而，由于腫瘤DNA含量較低，全基因組亞硫酸氫鹽目前在早期癌癥患者中仍難以敏感地檢測到這種低甲基化信號。
圖3. 甲基化影響轉(zhuǎn)錄水平
盡管越來越多的表觀遺傳生物標(biāo)記物被用來診斷癌癥，但如何確定具有足夠臨床準(zhǔn)確性的生物標(biāo)志物仍然是一個挑戰(zhàn)。如表1所示，單個標(biāo)記物或小panel的特異性較高，其敏感性通常不太理想。據(jù)Gai等人報道，肝組織和造血系統(tǒng)(背景DNA的主要來源)肝特異性生物標(biāo)志物的DNA甲基化水平分別為50%和5%。血漿cfDNA中有大量來源的造血系統(tǒng)提供的cfDNA，所以大量甲基化背景DNA分子可能影響測定的敏感性，即可能是由于背景DNA的噪聲所致。針對這個問題，最近的一些研究開發(fā)了復(fù)雜的統(tǒng)計算法和生物信息學(xué)策略，用于分析cfDNA表觀遺傳特征來提高敏感性。
Xu等人報道了使用高特異性的DNA甲基化生物標(biāo)記物用于肝癌患者的診斷和預(yù)后監(jiān)測（P＜0.001）。通過構(gòu)建了診斷和預(yù)測的醫(yī)學(xué)模型，利用這些生物標(biāo)志物采用Logistic回歸方法來提高準(zhǔn)確性。使用該種方法在肝癌診斷的敏感性和特異性上優(yōu)于甲胎蛋白(Alpha fetal protein, AFP)，AFP是目前唯一可用于肝癌檢測和監(jiān)測的血液檢測方法，但其臨床應(yīng)用受到敏感性低的限制[15]。
圖4. cd評分和AFP在肝癌診斷中的價值
Zhou和他的同事將血漿cfDNA模擬為腫瘤和正常組織DNA的混合物，然后使用概率模型預(yù)測腫瘤負(fù)荷和腫瘤類型。CancerLocator在模擬和實際數(shù)據(jù)方面優(yōu)于兩種已有的方法（SVM、RF），即使在血液腫瘤來源DNA的比例很低的情況下也是如此。詳見下圖，在早期腫瘤患者中，CancerLocator、RF、SVM的錯誤率分別為0.240、0.807、0.816[19]
圖5. 三種方法對十組模擬數(shù)據(jù)的分類性能
cfDNA斷裂模式研究及應(yīng)用
除了DNA甲基化外，最近的研究表明cfDNA片段化特征逐漸成為NIPT和癌癥液體活檢的一個新的具有潛力的研究方向。隨著研究的進展，大家逐漸發(fā)現(xiàn)cfDNA的片段化并不是完全隨機的，而是有著一定的規(guī)律。這表明在液體活檢中，cfDNA片段化特征可能包含著一定的臨床信息。需要注意的是目前關(guān)于cfDNA片段化特征的研究大多基于測序技術(shù)，是因為測序技術(shù)可以明確每個cfDNA分子的邊界和位置。近期的研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤患者中，腫瘤來源的ctDNA要短于背景cfDNA，利用該特征，如果對cfDNA進行片段篩選，能提高檢測的靈敏度[20]。Lam等人的研究中發(fā)現(xiàn)，利用腫瘤ctDNA來源的的片段大小特征進行篩選，可以提高鼻咽癌（NPC）早期篩查的效果[21]。
圖6. 鼻咽癌患者和EBV DNA結(jié)果持續(xù)陽性的非鼻咽癌患者(紅色曲線)和常染色體DNA(黑色曲線)的大小分布
然而，目前關(guān)于cfDNA斷裂模式的研究，無論是從生物學(xué)基礎(chǔ)上還是從臨床應(yīng)用上，都是相當(dāng)初步的，而且大多數(shù)研究仍處于原理的驗證階段。鑒于cfDNA片段化特征在NIPT中的廣泛應(yīng)用，將cfDNA片段化特征納入今后的腫瘤液體活檢研究同樣具有重要的臨床意義。
以DNA甲基化為基礎(chǔ)的表觀遺傳生物標(biāo)記物，和以cfDNA斷裂模式為切入點進行分析，對原發(fā)灶不明的轉(zhuǎn)移腫瘤組織溯源具有重要意義。原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特征很大程度上決定了轉(zhuǎn)移癌患者的預(yù)后情況，因此明確腫瘤來源對于確定治療方案以及改善預(yù)后意義重大，我們期待研究的進一步深入和快速轉(zhuǎn)化，盡早為患者們帶來福音 ！
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