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大佬說，我只說一次，你自己要記住
以最火熱的p53為例

Step 1 先找p53基因序列

1. NCBI--輸入p53并選擇物種human：tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

2. Ctrl+F，輸入sequence，快速定位（當(dāng)然其實拉下去就是了），點擊Genebank

3. 下載p53基因序列

4. 用SnapGene軟件打開序列，并簡單了解每個元件

最好是可以學(xué)一下SnapGene這個軟件的使用方法（有視頻），個人認(rèn)為，自行查資料理解每一個元件的含義和作用，可以幫助更快的補(bǔ)充背景知識。通過將散落的知識點集合起來，最后拼湊成自己的知識地圖。

在學(xué)生信的時候，聽到過一個詞，“可變剪接”，有了初步印象之后，在這里才算是實實在在看到了，我認(rèn)真的數(shù)了數(shù)，mRNA畫了15條，TP53蛋白也畫了15條。那么我們可以理解為，TP53有15個亞型，當(dāng)然，每個亞型都有自己的mRNA。

Step 2 分析敲除位點（找到合適的敲除位置）

怎么樣才能通過盡量少的sgNRA數(shù)量，去敲除盡量多的TP53蛋白。既然是做knockout，那一定是要所有的亞型都不能表達(dá)。那么既然如此，就是要敲除掉這些亞型共有的區(qū)域，而且越前面越好（如果只敲除尾巴，TP53合成了半個身子，半個身子的TP53說不定也能起作用），另外，也不能敲除掉內(nèi)含子（說是，如果敲掉了，可能會形成進(jìn)的剪接，就有新的蛋白出現(xiàn)）----知識點好伐~

1. 發(fā)現(xiàn)所有亞型共有區(qū)域

2. 查看詳細(xì)信息，得知第一個segment（片段）是從12417-12498，一共82 bp

3. 在Sequence中查看，復(fù)制一整個segment的堿基序列如下

segment堿基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

Step 3 設(shè)計sgRNA

首先，先附上鼎鼎大名的張峰實驗室提供的網(wǎng)頁 https://zlab.bio/guide-design-resources

1. 打開網(wǎng)頁，選擇網(wǎng)頁工具--博德研究所

2. 粘貼序列，一步到位

3. 查看結(jié)果

4. 選擇目的序列

略略略，哈哈哈哈哈~~

點，好看~