除了驗證miRNA-RNA的靶向關(guān)系以外，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)可以用來研究另一種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，即轉(zhuǎn)錄因子-啟動子區(qū)調(diào)控機(jī)制研究。在這套系統(tǒng)中，熒光素酶報告基因被用來模擬目的基因的轉(zhuǎn)錄情況。
目的基因的轉(zhuǎn)錄過程除了合成mRNA的RNA聚合酶（RNA polymerase）以外，還需要轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）的參與。眾多轉(zhuǎn)錄相關(guān)的因子共同聚合在一起形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能啟動基因轉(zhuǎn)錄的過程。
轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成必須有轉(zhuǎn)錄因子的參與。這是一類具有DNA結(jié)合能力的蛋白組成。他們通過DNA binding domain與啟動子區(qū)的特異性的motif結(jié)合，直接參與轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控。其中有的激活，增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性（稱之為activator），還有一些TF作為repressor反向調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。另外，還有一些蛋白，作為coactivator或者corepressor同樣參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，以非DNA binding的方式影響靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。
基于以上原理，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)便是非常適用于啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的極佳工具。
研究步驟：
首先，我們需要找到靶基因（Targetgene）的啟動子區(qū)序列。通過NCBI或UCSC數(shù)據(jù)庫可以很容易的得到靶基因的啟動子區(qū)序列。通常，我們選取-2000~-1共2000bp的序列作為研究對象。
之后，吉瑪可以通過全基因合成的方式將該段序列構(gòu)建于pGL3-basic載體中，得到靶基因的報告基因載體pGL3-Target_WT。如果你想研究目的基因（蛋白）是否對靶基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用，而目的基因恰好是轉(zhuǎn)錄因子，則可以通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測該轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子區(qū)序列是否結(jié)合，結(jié)合位點等信息。之后進(jìn)一步將預(yù)測結(jié)合位點做突變MUT，與WT相比較做進(jìn)一步驗證。
構(gòu)建待研究的目的基因（蛋白）的過表達(dá)或干擾載體，用于在報告基因系統(tǒng)中實現(xiàn)目的蛋白的差異表達(dá)，從而驗證出其對靶基因的調(diào)控關(guān)系。
實驗步驟方法詳見吉瑪基因雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛改?/strong>
預(yù)期結(jié)果示意圖如下
（1）待驗證的目的蛋白A不是轉(zhuǎn)錄因子。這種情況下該蛋白可能是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、coactivator或corepressor的活性或表達(dá)量來間接地調(diào)控靶基因B轉(zhuǎn)錄活性的。這種情況下因為目的蛋白A不與靶基因B的啟動子區(qū)DNA結(jié)合，則報告基因載體構(gòu)建只需要野生型WT來真實反映基因B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況。
EV: Empty Vector; POI:Protein of Interest
（2）待驗證的目的蛋白A是轉(zhuǎn)錄因子。這種情況下，目的蛋白A是通過與靶基因的啟動子區(qū)DNA直接結(jié)合今兒調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性的。因而，靶基因啟動子區(qū)DNA中與目的蛋白結(jié)合的motif是至關(guān)重要的。吉瑪基因通過全基因合成的方式將這個motif序列造成突變（亂序），所構(gòu)建成的MUT序列將失去與目的蛋白A結(jié)合的能力。目的蛋白與啟動子區(qū)DNA結(jié)合位點可通過一些生信預(yù)測網(wǎng)站實現(xiàn)，例如：Jaspar.genereg.net；
http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3；
https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/index.php
http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/等
總結(jié)：pGL3-basic雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，可以驗證目的蛋白與直接靶轉(zhuǎn)錄活性間的調(diào)控作用。吉瑪基因幫你做實驗，30-35工作日完成。敬請來電來信咨詢。
