原位激活心肌細(xì)胞（CM）增殖是用于在心臟損傷或疾?。ɡ缧募」Ｈ鸐I和心力衰竭）之后替代丟失或凋亡的CM的有前景的方法。非編碼RNA（ncRNA）在細(xì)胞周期調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，有可能促進(jìn)CM的增殖。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類新的ncRNA，通過將RNA的3'末端連接到5'末端而環(huán)化。circRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)保持其穩(wěn)定性并增強(qiáng)其與miRNA或者蛋白的結(jié)合能力。因此，circRNA可能比非環(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)心臟再生和誘導(dǎo)CM增殖方面更有效。此外，新證據(jù)表明circRNA可控制細(xì)胞增殖，分化，發(fā)育甚至組織再生。 CircRNA還參與心血管系統(tǒng)的生理和病理過程，包括心肌病的發(fā)展，CM肥大，衰老和細(xì)胞凋亡。最近高通量RNA測序揭示了新生兒和成人心臟之間經(jīng)常差異表達(dá)的circRNAs，這些失調(diào)的circRNA可能參與心臟再生。因此，由于circRNA在細(xì)胞增殖和CM功能中的重要作用,靶向circRNAs可能是促進(jìn)心臟再生的新策略。
在遺傳學(xué)中，超級(jí)增強(qiáng)子（SEs）是哺乳動(dòng)物基因組的區(qū)域，其包含多個(gè)增強(qiáng)子，其由一系列轉(zhuǎn)錄因子蛋白共同結(jié)合以驅(qū)動(dòng)參與細(xì)胞身份的基因的轉(zhuǎn)錄。由于超級(jí)增強(qiáng)子經(jīng)常在對控制和定義細(xì)胞身份重要的基因附近被識(shí)別，因此它們可用于快速鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞身份的關(guān)鍵基因。包含超級(jí)增強(qiáng)子的增強(qiáng)子共享增強(qiáng)子的功能，包括結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白，環(huán)化靶基因和激活轉(zhuǎn)錄。在超級(jí)增強(qiáng)子（例如CDK7，BRD4）處觀察到高水平的許多轉(zhuǎn)錄因子和輔因子。
來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科的賓建平教授研究團(tuán)隊(duì)最近在Circulation（IF=18.881）期刊上在線發(fā)表了題為“Loss of Super-Enhancer-Regulated CircRNA Nfix Induces Cardiac Regeneration After Myocardial Infarction in Adult Mice”的研究，通過整合RNA測序大數(shù)據(jù)和超級(jí)增強(qiáng)子（SEs）目錄，鑒定了與調(diào)節(jié)心臟再生有關(guān)的circRNA—circNfix。轉(zhuǎn)錄因子Meis1結(jié)合circNifx 基因座的SE，增強(qiáng)circNifx的表達(dá)；circNifx表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和血管生成，而抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡，從而改善心肌功能和預(yù)后。機(jī)制上，circNfix增強(qiáng)Ybx1與Nedd41的結(jié)合，誘導(dǎo)Ybx1的泛素化降解，抑制cyclin A2和cyclin B1表達(dá)；另一方面circNfix可以海綿miR-214，促進(jìn)其靶基因Gsk3β的表達(dá)，而抑制β-catenin的活性。該研究為改善心肌梗死后心肌功能和預(yù)后提供了新的靶點(diǎn)和治療策略。
1. circNifx是心臟SE相關(guān)的circRNA，在成年小鼠心肌細(xì)胞中富集表達(dá)
RNA測序揭示了新生兒和成年心臟之間差異表達(dá)的circRNAs，但是從眾多候選circRNAs篩選出對于心臟再生所必需的circRNAs是非常困難的。超級(jí)增強(qiáng)子（SEs）是一大群的活性增強(qiáng)子簇，其富集用于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。這些增強(qiáng)子簇是發(fā)育時(shí)期和細(xì)胞類型特異性的，通過調(diào)控細(xì)胞身份基因或ncRNA表達(dá)來影響細(xì)胞分化和發(fā)育。超級(jí)增強(qiáng)子經(jīng)常在對控制和定義細(xì)胞身份重要的基因附近被識(shí)別，因此它們可用于快速鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞身份的關(guān)鍵基因。重要的是，已發(fā)現(xiàn)SE相關(guān)的ncRNA可促進(jìn)心臟發(fā)生和CM分化，這兩者都是CM增殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作者假設(shè)SE很可能標(biāo)記控制CM分化和發(fā)育的circRNA，從而幫助鑒定調(diào)節(jié)心臟再生的關(guān)鍵circRNA。根據(jù)H3K27ac標(biāo)記的存在來定義，由23種人體組織中產(chǎn)生的增強(qiáng)子目錄，每種增強(qiáng)子對應(yīng)circRNAs的最近端啟動(dòng)子。各種circRNAs與SEs在空間上相關(guān)，被命名為SE-circRNAs。 SEs可標(biāo)記表達(dá)豐富、組織表達(dá)特異性和發(fā)育時(shí)期特異的circRNAs。
通過對新生和成年大鼠心臟的circRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出在人、小鼠和大鼠中序列相對保守的circRNAs，接著利用SEs篩選出心臟發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)的SE相關(guān)的circRNAs。CircRNA_Nfix 和circRNA_Slc8a1是主要的發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)的候選circRNA。作者發(fā)現(xiàn)circRNA_Nfix在心肌細(xì)胞CMs中的表達(dá)量明顯高于circRNA_Slc8a1的。而相比于新生小鼠心臟和CMs，Nfix mRNA表達(dá)水平在成年小鼠心臟和CMs明顯升高。RT-PCR、RNase R和放線菌素D處理證明circNfix的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。circNfix序列在人、小鼠和大鼠之間的保守性高達(dá)95%。circNfix在小鼠多種組織均有表達(dá)，尤其在心臟中豐富表達(dá)；相比于心臟其他類型細(xì)胞，circNfix在CMs中明顯高表達(dá)；從小鼠新生到成年的心臟發(fā)育過程，circNfix在CMs中的表達(dá)水平逐漸上調(diào)。新生小鼠（P0）經(jīng)誘導(dǎo)心肌梗死7天后，可在梗死的邊緣區(qū)域，觀察到circNfix表達(dá)水平下調(diào)，而心肌細(xì)胞增殖活躍；8周成年小鼠（P56）經(jīng)誘導(dǎo)心肌梗死7天后，觀察到circNfix的表達(dá)水平上調(diào)，而心肌細(xì)胞增殖不活躍。RNA FISH實(shí)驗(yàn)證明circNfix主要定位于P7小鼠心肌細(xì)胞胞漿中表達(dá)。
2. circNfix表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)體外CM的增殖
利用siRNA敲低circNfix表達(dá)，顯著地增加P7 小鼠心肌細(xì)胞周期活性標(biāo)志物（Ki67、EdU、pH3、Aurora）的表達(dá)和心肌細(xì)胞去分化標(biāo)志物（Nkx2.5、a-SMA、RUNX1和DAB2）的表達(dá)，流式結(jié)果也證明敲低circNfix表達(dá)導(dǎo)致P7 CM細(xì)胞阻滯在S和G2/M期，而且促進(jìn)P7 小鼠心肌細(xì)胞的分裂；circNfix過表達(dá)則抑制P0 心肌細(xì)胞的增殖。
3. circNfix表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)體內(nèi)CMs的增殖
體內(nèi)利用AAV病毒敲低circNfix表達(dá)14天后，IF染色心臟發(fā)現(xiàn)，敲低circNfix表達(dá)顯著性提高心臟中增殖的CMs的比例和總的CMs數(shù)目，促進(jìn)RUNX1蛋白的表達(dá)，提示下調(diào)circNfix表達(dá)可誘導(dǎo)CM的去分化和再分化后的增殖。向心臟注射了AAV9-shcircNfix后分離CMs后體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)總的CM數(shù)目和pH3+或者 Ki67+ CMs比例也明顯增加。
4. 在心肌梗死后circNfix表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)成年小鼠的心臟再生
為了評(píng)估在心肌梗死發(fā)生時(shí)，circNfix表達(dá)下調(diào)對心肌修復(fù)和心肌功能的維持的影響，作者構(gòu)建心肌梗死模型后在梗死外周區(qū)域注射AAV9-shcircNfix 或者 AAV9-shNC，敲低circNfix表達(dá)會(huì)明顯增加梗死邊界區(qū)域的增殖性CMs的比例，明顯降低凋亡性CMs的數(shù)目，增加IB4+, CD31+ 或者 vWF陽性血管的密度，提示敲低circNfix表達(dá)可誘導(dǎo)心臟再生的過程。
circNfix表達(dá)下調(diào)對于心肌功能修復(fù)的影響：超聲波心動(dòng)描記術(shù)揭示circNfix表達(dá)下調(diào)可以維持而不降低射血分?jǐn)?shù)EF和左室短軸縮短率FS。PET/CT, TTC染色和Masson trichrome 染色揭示circNfix表達(dá)下調(diào)可以明顯減少心臟梗死面積和纖維化的程度。而且circNfix表達(dá)下調(diào)組小鼠的生存率明顯高于shNC組小鼠的。
5. 過表達(dá)circNfix可抑制新生小鼠CM的增殖
體內(nèi)利用ADV病毒過表達(dá)circNfix 4天后，IF染色心臟發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circNfix可顯著性減少心臟中增殖的CMs的比例和總的CMs數(shù)目，增加梗死邊界區(qū)域的TUNEL+CMs的比例，抑制IB4, α-SMA 或者 CD31陽性血管的密度，抑制心肌梗死后心臟的血管再生，明顯降低心臟射血分?jǐn)?shù)EF，增加心肌梗死面積，提示在新生小鼠模型中過表達(dá)circNfix可抑制心肌細(xì)胞的增殖，抑制心臟再生修復(fù)的功能。
6. Meis1通過結(jié)合Nfix基因座上的SE，調(diào)控circNfix的表達(dá)
在人和小鼠心臟中存在與Nfix基因座結(jié)合的超級(jí)增強(qiáng)子SEs。ChIP-seq數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)該SE結(jié)合區(qū)域還存在其他SE標(biāo)志修飾，如H3K4me1, H3K27me3, P300 和DNase Hypersensitive Site (DHS)。在成年心臟中circNfix的表達(dá)水平增加，伴隨著在Nfix基因座上的活性組蛋白標(biāo)志修飾增加，而失活性組蛋白標(biāo)志修飾減少。Meis1的ChIP-seq profile揭示Meis1峰值與circNfix相關(guān)的SE有重疊，而且該重疊區(qū)域序列在不同種屬間高度保守(A-C)；circNfix-SE分為E1, E2, E3, E4，分別被克隆在enhancer-reporter載體后在CM中檢測其活性，發(fā)現(xiàn)E2增強(qiáng)子被高度活化(D)。EMSA和ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Meis1與 E2的結(jié)合作用(F-G)。沉默Meis1 表達(dá)明顯抑制circNfix的表達(dá)，而促進(jìn)Nfix mRNA的表達(dá)(H-I)。沉默Meis1 表達(dá)可促進(jìn)CMs的增殖，而過表達(dá)circNfix則抵消這個(gè)效應(yīng)（J）,這些結(jié)果提示Meis1與 circNfix_SE的相互作用緊密地調(diào)控circNfix的表達(dá)水平。
7. circNfix促進(jìn)Ybx1 的泛素化降解
biotin標(biāo)記探針捕獲circNfix后，質(zhì)譜分析沉淀物，鑒定出富集最多的蛋白就是Ybx1。WB和RIP實(shí)驗(yàn)證明了circNfix與Ybx1的結(jié)合作用（A-B）；敲低circNfix表達(dá)顯著性抑制Ybx1蛋白的表達(dá)，不抑制 Ybx1 mRNA的表達(dá)，而MG132處理可以抑制Ybx1蛋白水平的降低（C-D），提示Ybx1蛋白有可能經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解；circNfix過表達(dá)促進(jìn)Ybx1蛋白移位到胞漿，并促進(jìn)其降解（G）。敲低或過表達(dá)circNfix 分別可以減少或者增加Ybx1的泛素化。質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶Nedd4l有可能參與Ybx1的泛素化降解。Protein docking program預(yù)測和Co-IP證明了Ybx1和Nedd4l的相互結(jié)合。RNA pulldown和 RIP實(shí)驗(yàn)則證明了circNfix與Nedd4l的相互結(jié)合作用。circNfix的表達(dá)不會(huì)影響到Nedd4l的表達(dá)，而會(huì)影響到Y(jié)bx1 與 Nedd4l的相互作用（J）。沉默Nedd4l的表達(dá)增加Ybx1蛋白的穩(wěn)定性，抵消了circNfix過表達(dá)后降低Ybx1蛋白的效應(yīng)（K-L）。
據(jù)報(bào)道，核Ybx1可結(jié)合cyclin A2 和cyclin B1的啟動(dòng)子，并活化其轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步驗(yàn)證，敲低Ybx1表達(dá)可顯著性降低cyclin A2 和cyclin B1蛋白水平，抵消了敲低circNfix表達(dá)導(dǎo)致cyclin A2 和cyclin B1蛋白水平升高的效應(yīng)（H）；ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)也證明了Ybx1與cyclin A2 和cyclin B1啟動(dòng)子的相互結(jié)合作用（I）；沉默Ybx1表達(dá)可抵消沉默circNfix表達(dá)后誘導(dǎo)CM增殖的效應(yīng)。以上結(jié)果提示，circNfix通過促進(jìn)Ybx1 的泛素化降解，抑制CM的增殖。
8. CircNfix 可以海綿miR-214，調(diào)節(jié)CM的增殖能力
經(jīng)生信分析預(yù)測，兩種miR-214和761與CircNfix有著最多的相互結(jié)合位點(diǎn)，其中miR-214在心肌中的表達(dá)水平更高，而且CircNfix表達(dá)下調(diào)可以顯著性上調(diào)miR-214的表達(dá)，接著luciferase reporter, RNA pulldown和 RNA FISH實(shí)驗(yàn)證明了miR-214 與 circNfix的相互結(jié)合作用。
通過過表達(dá)miR-214，作者分析對miR-214下游可能的靶基因，篩選到與心臟再生有關(guān)的靶基因—Gsk3β， miR-214與 Gsk3β 3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)在種屬間高度保守。Luciferase reporter和 RNA FISH體外實(shí)驗(yàn)證明了miR-214 與 Gsk3β的相互作用， CircNfix過表達(dá)提高其熒光素酶活性，而miR-214過表達(dá)則抑制其活性。
在心臟中敲低CircNfix表達(dá)可顯著性抑制Gsk3β的表達(dá)，而miR-214抑制劑則抵消該抑制效應(yīng)。MiR-214 mimics抑制，而miR-214 抑制劑促進(jìn)Gsk3β的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，Gsk3β通過降解β-catenin而調(diào)節(jié) CM的增殖。與此一致的是，敲低CircNfix表達(dá)可以顯著性抑制β-catenin的表達(dá)；Meis1表達(dá)下調(diào)顯著性抑制Gsk3β的表達(dá)，而過表達(dá)CircNfix則逆轉(zhuǎn)該抑制效應(yīng)。抑制miR-214表達(dá)會(huì)抵消circNfix或Gsk3β表達(dá)下調(diào)促進(jìn)CM增殖的效應(yīng)。無論是否同時(shí)還是單獨(dú)抑制Ybx1或 miR-214表達(dá)，都會(huì)抵消circNfix表達(dá)下調(diào)促進(jìn)CM增殖的效應(yīng)?？傊?，作者圍繞著Meis1/circNfix/miR-214/Gsk3β/β-cateninh和circNfix/Ybx1/ cyclin A2和cyclin B1兩條調(diào)節(jié)通路進(jìn)行正反向的功能驗(yàn)證，說明這兩條通路對于調(diào)控CM增殖的有效性。
參考文獻(xiàn)
1. Huang S, Li X, Zheng H, et al. Loss of Super-Enhancer-Regulated CircRNA Nfix Induces Cardiac Regeneration After Myocardial Infarction in Adult Mice. Circulation. 2019 Apr 5. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361.
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